《Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation》：Genetic Variation Underlying CSF Natural Killer T-Cell Frequency in Inflammatory CNS Diseases: A Genome-Wide Association Study
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背景与目的：自然杀伤T细胞（NKT细胞）桥接固有免疫与适应性免疫，并在自身免疫性疾病的免疫调节中发挥重要作用。在多发性硬化（MS）中，已有研究报道脑脊液（CSF）中NKT细胞频率降低，但其在疾病发病机制中的作用仍不清楚。本研究探讨了MS及其他中枢神经系统（CN
背景与目的：自然杀伤T细胞（NKT细胞）桥接固有免疫与适应性免疫，并在自身免疫性疾病的免疫调节中发挥重要作用。在多发性硬化（MS）中，已有研究报道脑脊液（CSF）中NKT细胞频率降低，但其在疾病发病机制中的作用仍不清楚。本研究探讨了MS及其他中枢神经系统（CNS）疾病患者CSF NKT细胞频率变异背后的遗传结构。
方法：研究人员对456例MS患者的CSF NKT细胞频率进行了全基因组关联研究（GWAS），并在一个包含90例MS或其他炎性CNS疾病患者的独立队列中进行了验证。功能随访评估了先导变异对CSF CD4+ T细胞中整合素亚基β5（ITGB5）基因表达的影响，并采用孟德尔随机化（MR）分析评估因果关系。此外，研究人员还检验了先导变异及CSF NKT细胞频率与以年龄相关多发性硬化严重程度评分（ARMSS）衡量的MS疾病严重程度之间的关联。
结果：研究人员发现并验证了一个新的全基因组显著关联，即rs6783734*C（联合p = 4.57 × 10?9）——位于3号染色体ITGB5基因内的一个内含子变异——与CSF NKT细胞频率升高相关。该关联在368例患有其他神经系统疾病的对照组中不存在（p = 1.4 × 10?1），提示其具有情境特异性效应。rs6783734与CSF CD4+ T细胞中ITGB5基因表达降低相关，MR分析支持ITGB5表达与CSF NKT细胞频率之间存在因果关系。尽管rs6783734与疾病严重程度无关，但较高的CSF NKT细胞频率与≥1年随访时的更高ARMSS评分相关（p = 9.33 × 10?3）。
讨论：本研究结果提示ITGB5可能是炎性CNS疾病中免疫细胞动力学的潜在情境依赖性调节因子，将遗传变异与CNS区室内的NKT细胞频率联系起来。鉴于整合素在免疫细胞运输中的核心作用以及整合素靶向药物在MS中的治疗成功，这些结果强调了整合素介导的通路是CNS免疫反应的决定因素。尽管观察到的较高CSF NKT细胞频率与较大疾病严重程度之间的关联提示，整合遗传因素与免疫表型最终可能有助于患者分层，但该发现仍需在更大规模的研究中加以确认。
一、研究背景与科学问题
自然杀伤T细胞（NKT细胞）是一类同时表达T细胞受体与自然杀伤（NK）细胞谱系表面受体的独特淋巴细胞群体。在脂质抗原通过非经典主要组织相容性复合体I类分子CD1d呈递后，NKT细胞能够迅速释放大量细胞因子，在免疫应答的启动与维持中发挥关键调控作用，被视为桥接固有免疫与适应性免疫的重要介质。越来越多的证据表明NKT细胞在自身免疫性疾病中具有调节功能。多发性硬化（MS）是一种以中枢神经系统（CNS）慢性炎症为特征的疾病，是青壮年神经功能障碍的主要原因，其病理机制涉及针对富含脂质的髓鞘的自身免疫反应，导致脱髓鞘并最终引发神经退行性变。已有研究报道，与健康个体相比，MS患者脑脊液（CSF）和外周血中的NKT细胞频率均降低。然而，NKT细胞在MS发病机制中的具体作用仍不清楚，尤其是其频率变异的遗传基础尚未被系统阐明。既往大规模全基因组关联研究（GWAS）已证实遗传因素主要通过对周围免疫系统的影响参与MS易感性，而针对MS严重程度的最大规模遗传学研究则提示CNS内在机制而非免疫机制在疾病进展中发挥作用。尽管如此，MS易感性与严重程度背后的遗传结构仍未完全阐明。本研究旨在通过GWAS探究常见遗传变异与CSF NKT细胞频率之间的关系，揭示遗传因素塑造CNS内NKT细胞介导的免疫调节的机制及其与MS病程的潜在关联。
二、研究设计与主要发现
研究人员从慕尼黑工业大学（TUM）大学医院神经内科2008年至2021年间确诊的MS或临床孤立综合征（CIS）患者中回顾性筛选出发现队列，共456例，均具有基因分型数据和CSF白细胞流式细胞术数据。验证队列包含90例MS或其他炎性CNS疾病患者，其中38例MS或CIS患者因缺乏基因分型数据而为本研究专门进行了基因分型。对照组包含368例患有其他神经系统疾病或症状的个体。研究人员对CSF NKT细胞频率进行了GWAS分析，发现并验证了位于3号染色体ITGB5基因内含子中的rs6783734*C变异与CSF NKT细胞频率升高显著相关（联合p = 4.57 × 10?9）。该关联在MS患者中具有情境特异性，在对照组中不存在。功能随访分析显示，rs6783734与CSF CD4+ T细胞中ITGB5基因表达降低相关，共定位分析支持CSF NKT细胞频率与ITGB5表达共享同一遗传信号，孟德尔随机化（MR）分析进一步支持ITGB5表达与CSF NKT细胞频率之间存在负向因果关系。此外，研究发现较高的CSF NKT细胞频率与≥1年随访时更高的年龄相关多发性硬化严重程度评分（ARMSS）相关，提示其可能具有预后价值。该研究的重要意义在于首次揭示了ITGB5位点对CNS内NKT细胞频率的遗传调控作用，鉴于整合素在免疫细胞运输中的核心作用以及整合素靶向药物（如那他珠单抗）在MS中的确切疗效，这些发现强调了整合素介导的通路在塑造CNS免疫反应和疾病进程中的重要性，并为基于遗传-免疫表型关系的精准医学患者分层策略提供了新思路。
三、关键技术方法
本研究采用以下核心技术方法：基于Illumina Global Screening Array（GSA）v3平台的基因分型与基于1000 Genomes phase 3参考面板的基因型填充；利用PLINKv2.0对秩次逆正态变换后的CSF NKT细胞频率进行线性回归GWAS分析；采用FINEMAP进行精细定位；利用单细胞RNA测序数据开展表达数量性状位点（eQTL）分析；采用联合似然映射（JLIM）进行共定位分析；使用TwoSampleMR包进行顺式孟德尔随机化（cis-MR）分析；基于扩展残疾状态量表（EDSS）评分计算ARMSS评分以评估疾病严重程度。
四、研究结果
ITGB5位点的遗传变异与MS及其他炎性CNS疾病患者CSF NKT细胞频率相关：发现队列包含456例MS或CIS患者，中位CSF NKT细胞频率为0.7%，显著低于对照组（中位1.5%）。GWAS分析在3号染色体上识别出全基因组显著关联信号，先导变异rs6783734位于ITGB5基因内含子中，其最小等位基因rs6783734C与较高的CSF NKT细胞频率相关（β = 0.45，SE = 0.08，p = 3.25 × 10?08），符合加性遗传模型。该发现在独立队列中得到验证（β = 0.32，SE = 0.18，pone-sided = 4.18 × 10?02，联合p = 4.57 × 10?9），并在未接受免疫调节治疗的患者亚组中保持稳健。该关联在对照组中不存在，SNP×疾病交互检验证实了这一情境特异性效应。在外周血中，rs6783734C也与较高的NKT细胞频率相关，但效应量较小。精细定位确定了包含32个高连锁不平衡（LD）变异的95%可信集合，先导变异rs6783734具有最高的后验包含概率（PIP = 0.109），但无变异达到0.8以上的PIP，提示在该区域广泛的LD下无法确定因果变异。
rs6783734与CSF T细胞中ITGB5基因表达相关：利用96例MS及其他神经系统疾病患者的CSF细胞单细胞RNA测序数据，研究人员发现rs6783734*C等位基因与CSF CD4+ T细胞中ITGB5表达降低相关（β = ?0.66，SE = 0.22，p = 3.12 × 10?3），在CD8+ T细胞中效应方向一致并达到名义显著（β = ?0.459，SE = 0.228，p = 4.71 × 10?02）。由于NKT细胞数量极少，无法直接分析该细胞群中的ITGB5表达。共定位分析（JLIM）提供了显著证据（p = 8.10 × 10?3），表明CSF NKT细胞频率与CSF CD4+ T细胞中ITGB5表达共享共同的遗传关联信号。
CSF NKT细胞频率与ITGB5表达之间存在因果关系的证据：以rs6783734作为单一工具变量采用Wald比率法进行MR分析，揭示了负向因果关系：CD4+ T细胞中较高的ITGB5表达与较低的CSF NKT细胞频率相关（β = ?0.614，SE = 0.124，p = 7.18 × 10?7）。使用7个工具变量的敏感性分析在IVW（p = 1.10 × 10?2）、MR-Egger（p = 4.79 × 10?2）和MR-RAPS（p = 7.79 × 10?3）方法中均得到方向一致的估计结果。
较高的CSF NKT细胞频率与更大的未来MS疾病严重程度相关：在424例具有EDSS数据的MS患者亚队列中，研究人员未发现CSF NKT细胞频率与腰椎穿刺时ARMSS评分之间的关联（β = 0.060，SE = 0.050，p = 2.31 × 10?1）。但在340例最近一次EDSS评估在腰椎穿刺后至少365天的患者中，较高的CSF NKT细胞频率与更高的ARMSS评分显著相关（β = 0.103，SE = 0.040，p = 9.33 × 10?3），该关联在进一步调整CSF白细胞计数后仍保持名义显著（β = 0.100，SE = 0.040，p = 1.22 × 10?2）。rs6783734与腰椎穿刺时（β = 0.049，SE = 0.105，p = 6.44 × 10?1）或末次随访时（β = ?0.034，SE = 0.093，p = 7.13 × 10?1）的ARMSS评分均无关联。
五、讨论与结论
ITGB5编码整合素家族中的跨膜蛋白，介导细胞黏附、迁移和信号转导。既往研究主要关注其在肿瘤中的作用，而在自身免疫性疾病中的贡献尚不清楚。本研究发现rs6783734C与CSF CD4+ T细胞中ITGB5表达降低相关，共定位分析支持共享遗传信号，MR分析提示ITGB5表达与CSF NKT细胞频率之间存在负向因果关系。尽管ITGB5表达降低与NKT细胞频率升高看似矛盾，但整合素不仅促进细胞迁移，还调节黏附强度、组织滞留、存活和激活阈值，因此ITGB5表达降低可能以非线性方式改变免疫细胞运输动力学，在炎性环境中可能有利于NKT细胞在CNS中的蓄积而非阻碍其进入。此外，该关联也可能是间接的，ITGB5在其他免疫细胞群中的表达改变可能通过影响细胞因子产生或局部免疫激活状态，为NKT细胞在CSF中的持续存在或扩增创造条件。研究人员还观察到rs6783734C与CSF B细胞和浆细胞频率之间的负向关联，但未通过多重检验校正。在疾病严重程度方面，较高的CSF NKT细胞频率与腰椎穿刺至少1年后的更大残疾相关，提示CSF NKT细胞可能具有预后价值，但需在更大队列中验证。rs6783734与疾病严重程度无关联，且与MS易感性亦无关联（OR = 1.03，p = 0.158）。研究存在若干局限性，包括NKT细胞数量限制导致无法直接分析其ITGB5表达、流式细胞术定义可能包含其他不变T细胞亚群、eQTL数据集较小限制MR工具强度等。综上所述，本研究识别出ITGB5位点的一个遗传变异，影响MS及其他炎性CNS疾病患者CSF及外周血中的NKT细胞频率，其关联可能通过ITGB5表达的调控效应介导，但该关系可能具有间接性。结合既往报道的MS中NKT细胞频率降低以及本研究发现的高CSF NKT细胞水平与后续更大残疾之间的关联，ITGB5可能是免疫细胞动力学的潜在调节因子，具有临床相关性。该发现强调了整合素介导的通路在塑造CNS免疫反应和疾病进程中的重要性，并展示了整合遗传因素与免疫表型关系在精准医学患者分层中的应用价值。
