野生型与重组腺相关病毒（AAV）生产比较揭示显著差异的生产力与内容比率特征

《Biotechnology Journal》：Comparison of Wildtype and Recombinant Adeno-Associated Virus (AAV) Production Reveals Distinct Productivity and Content Ratio Profiles

　　

摘要专业翻译 重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）是基因治疗领域领先的病毒载体。然而，重组腺相关病毒生产系统的滴度（titer）和内容比率（content ratio，即含基因组衣壳占总腺相关病毒衣壳的比例）较低，难以产生临床或商业应用所需的大量载体基因组（vector genomes, VG）。相比之下，野生型腺相关病毒（wildtype adeno-associated virus, wtAAV）的滴度比重组腺相关病毒高十倍以上，内容比率超过95%为全颗粒（full）。尽管野生型腺相关病毒具有更高的生产力，但其生产力背后的机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员在悬浮人胚胎肾细胞（human embryonic kidney cells, HEK293）中，在不同腺相关病毒与腺病毒（adenovirus, AdV）感染复数（multiplicity of infection, MOI）条件下，开发并表征了一种新型野生型腺相关病毒生产平台。通过比较基于感染的系统与基于转染的系统以及感染-转染杂交系统，研究了细胞病毒基因组递送机制的影响以及腺相关病毒与其腺病毒辅助病毒之间的相互作用。野生型和杂交感染系统表现出显著不同的宿主细胞生长曲线和病毒基因表达模式，其滴度比重组转染系统高出一个数量级以上，内容比率高出45%，达到8.1 × 1012载体基因组/mL培养物和72.2%全颗粒，而重组转染系统仅为1.63 × 1011载体基因组/mL和26.9%全颗粒。

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一、研究背景与问题

重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）因其低免疫原性、良好的安全性、血清型特异性趋向性以及稳定的长期附加体表达，已成为体内基因治疗的首选载体。目前美国已有超过200项基于rAAV的疗法进入临床试验，九项治疗产品已获美国食品药品监督管理局或欧洲药品管理局批准。尽管悬浮培养和阴离子交换色谱等技术进步降低了rAAV基因治疗产品的生产成本，但单剂成本仍可达约5万美元，凸显持续工艺优化的必要性。据估计，当前生产能力需扩大至少1至2个数量级才能满足预期的临床和商业需求。

当前rAAV生产存在效率低下的问题，内容比率低（通常为5%至30%全颗粒），滴度仅为1至5 × 10¹¹载体基因组（vector genomes, VG）/mL培养物。相比之下，野生型腺相关病毒（wildtype AAV, wtAAV）表现出10至100倍更高的生产力，并产生超过95%的全衣壳。尽管wtAAV天然具有更高的滴度和内容比率，但其在工业相关条件下的系统性评估仍然有限，先前的研究主要集中在贴壁细胞系统。此外，wtAAV的复制和包装受Rep、Cap和辅助病毒因子之间复杂反馈环路的调控，这些机制虽经数十年研究，但对其影响载体产量和基因组衣壳化的机制仍仅部分了解。

二、研究内容与结论

本研究在悬浮细胞中，在不同感染复数（multiplicity of infection, MOI）和不同转基因条件下，系统评估了wtAAV和rAAV在感染、转染及杂交系统中的表现。研究比较了五种不同的AAV生产系统：三质粒转染（triple plasmid transfection, TT）、野生型感染（wildtype infection, INF）、wtAAV2/2双质粒转染（wildtype dual transfection, WT DT）、野生型AAV感染-腺病毒转染杂交（AAV INF-ADV T）以及野生型腺病毒感染-AAV转染杂交（ADV INF-AAV T）。研究结果表明，野生型感染系统在滴度和内容比率方面均显著优于转染系统，且基因递送方式对宿主细胞活力、病毒基因表达模式和生产结果具有决定性影响。该研究为合理设计具有更高产量和包装质量的rAAV生产平台提供了框架。

三、关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：悬浮人胚胎肾细胞（Expi293F）培养系统；野生型AAV2（VR-680）和腺病毒5型（VR-5，ATCC来源）的感染体系；三质粒转染和双质粒转染体系；感染-转染杂交体系；实时荧光定量PCR（qPCR）用于载体基因组滴度测定；阴离子交换高效液相色谱（AEX-HPLC）用于内容比率测定；逆转录定量PCR（RT-qPCR）用于病毒基因表达分析；流式细胞术用于转染效率评估。研究设置了3个生物学重复（感染和转染条件）和2个生物学重复（杂交条件）。

四、研究结果

2.1 wtAAV感染（INF）比三质粒转染（TT）具有更高的滴度和内容比率

四种wtAAV和AdV感染条件在测试的14种条件中产生了最高的VG滴度。最佳条件MOI 100:1平均产生8.1 × 10¹² VG/mL培养物，比最高转染条件（HGH，1.8 × 10¹² VG/mL）高四倍以上，比EGFP转染（1.63 × 10¹¹ VG/mL）高五十倍。野生型感染一致产生最高的内容比率。在感染条件中，wtAAV:AdV MOI显著影响内容比率，100:1 MOI条件产生最高比例的全衣壳（66.2%）。将wtAAV MOI固定在500，AdV MOI增加5倍（500:2至500:10）使全衣壳比例从62.0%降至35.1%，表明升高的AdV辅助病毒输入可能导致较低的内容比率。转基因身份对滴量、内容比率和宿主细胞活力的影响小于病毒基因递送方式的影响。

2.2 感染-转染杂交条件（AAV INF-ADV T和ADV INF-AAV T）揭示基因表达错配对滴度和内容比率的影响

wtAAV感染-AdV转染杂交条件（AAV INF-ADV T）比AdV感染-AAV转染杂交条件（ADV INF-AAV T）具有更高的VG滴度。AAV INF-ADV T条件的滴度比MOI 100:1感染低13至18倍。ADV INF-AAV T条件的滴度也低于双转染（WT DT）。各水平杂交条件之间无显著差异，表明病毒基因递送方式对VG滴度的影响大于wtAAV:AdV辅助基因比率的变异。

2.3 wtAAV与AdV之间的相互作用可能影响活力、滴度和内容比率

较高的AdV MOI与较低的VG滴度相关，无论wtAAV MOI如何。将wtAAV MOI固定在500，AdV MOI增加5倍使VG滴度从6.72 × 10¹²降至4.64 × 10¹² VG/mL。AdV辅助输入对最终载体产量的影响可能强于初始wtAAV基因组递送。AAV INF-ADV T条件（wtAAV MOI = 100）产生高内容比率（72.2%全颗粒），但VG滴度比100:1感染低约18倍。AdV滴度数据显示wtAAV对AdV存在天然抑制作用的证据。两个最高AdV滴度条件对应于AdV感染系统中两个最低的AAV滴度，表明AdV与wtAAV滴度之间存在负相关。

2.4 基因递送模式驱动不同AAV生产系统中生长和活力的差异

野生型感染的特点是病毒载量积累较慢，AAV基因组拷贝数随时间逐渐增加，而三质粒转染在转染时递送最大基因拷贝数，随后质粒在整个培养过程中逐渐降解。感染培养在感染后前48小时保持较高活力，但在感染后最后48小时活力显著降低。转染条件在转染后前48小时活力较低，但在培养后半段未表现出同样陡峭的活力下降。感染条件在AdV MOI与活力之间呈反比关系，96小时时活力随MOI降低的顺序为100:1 > 500:2 > 200:5 > 500:10。到96小时，所有感染条件均显示活力降低（<20%）。

2.5 转染条件表现出转基因依赖的细胞活力效应

EGFP、HFIX和HGH转染条件的培养结束活力显著高于感染条件。野生型转染在转染条件中始终显示最低活力，其时间活力趋势与感染条件观察到的相似，表明关键病毒基因的表达可在HEK293细胞中产生细胞毒性效应。在杂交条件中，ADV INF-AAV T导致比AAV INF-ADV T更低的活力。感染条件下，活细胞密度（viable cell density, VCD）与AdV MOI呈负相关，与活力趋势一致。

2.6 感染、转染和杂交生产策略之间出现不同的时间基因表达模式

感染条件在24小时时所有AAV基因表达较低（0.1至0.2倍对照），但到96小时急剧增加。例如，96小时时Cap2表达比野生型双转染高8.5倍，Rep78表达趋势高59倍，E4orf6表达趋势高2000倍。MOI 100:1感染在晚期表达中始终优于MOI 500:2。转染条件在转染时递送高初始基因拷贝数，随后随质粒降解逐渐下降。杂交条件表明基因表达强烈依赖于AAV与AdV组分的递送途径，两种可能配置之间表现出不对称性。AAV INF-ADV T条件在所有基因和时间点的表达始终低于对照，而ADV INF-AAV T条件在96小时表现出显著升高的表达——AAV基因高达50倍，E1A/E1B/E2A高达100倍，E4orf6达到对照的1000倍。

五、讨论与结论

讨论部分指出，wtAAV感染与培养早期较高的细胞活力相关，而rAAV转染显示较低的活力，这可能导致了产量降低。wtAAV复制受精细调控网络控制，其中Rep、Cap和辅助病毒功能按严格的时间顺序表达，而这一网络在rAAV中严重失调。在wtAAV感染中，Rep78/68通过直接结合两个AdV启动子（E2A和主要晚期启动子MLP）抑制AdV复制，同时通过Rep与转录共因子和信号节点的相互作用对其他AdV早期启动子产生间接效应。AdV E1A还反式激活wtAAV P5，增强Rep表达，形成负反馈环路。这一调控机制可能解释了野生型条件为何维持更高的活力和VCD、协调的Rep/Cap表达以及改善的VG滴度和内容比率。

研究结果提出了优化rAAV生产的几个潜在方向：辅助元件的时机、递送和数量可显著影响宿主细胞活力、滴度和产品质量；平衡的辅助表达对AAV生产至关重要；过度的辅助病毒活性可能促进空衣壳的形成；转基因的顺式作用特征如有效载荷大小、GC含量、二级结构和启动子-ITR相互作用可影响包装格局和产量。研究还构建了更稳定的wtAAV2基因组质粒pwtAAV2/2，避免了ITR区域的自发突变和塌缩问题，确保了研究结果不含质粒不稳定伪影。

研究结论：野生型AAV在测试条件下始终优于重组AAV，具有更高的滴度和更高比例的全颗粒。基因递送方式、AdV相互作用和转基因身份显著影响宿主细胞活力、AAV滴度和内容比率。感染-转染杂交系统揭示了基因表达错配对生产结果的影响。这些发现为开发具有改善产量和包装质量的rAAV生产平台提供了框架。