基于线粒体多基因位点的灰椋鸟新种等孢球虫（Isospora muku n. sp.）的形态学与分子系统学鉴定

《International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife》：A new Isospora species (Apicomplexa: Eimeriidae) from the White-cheeked Starling, Spodiopsar cineraceus (Passeriformes: Sturnidae), in Japan

　　

从日本灰椋鸟（Spodiopsar cineraceus）中鉴定出一种新的等孢球虫（Isospora）物种。本研究描述了Isospora muku n. sp.，这是首次从灰椋鸟属（Spodiopsar）宿主中描述的球虫。形态学上，卵囊呈球形至近球形，大小23.1 × 22.2 μm，L/W比值为1.04；孢子囊呈卵圆形，大小16.4 × 10.3 μm，具有斯泰达体（Stieda body）、亚斯泰达体（substieda body）和孢子囊残体。椋鸟科（Sturnidae）等孢球虫的卵囊形态高度相似，难以仅凭形态学区分物种。研究人员通过两个线粒体位点（MAVCOX1和MARI）的独特序列支持该新种的确立。系统发育分析显示，来自椋鸟宿主的等孢球虫谱系呈多系发生，提示可能存在宿主转换现象。本研究结合形态学与分子数据，为日本野生雀形目鸟类球虫多样性研究提供了重要参考。

论文解读：灰椋鸟新种等孢球虫（Isospora muku n. sp.）的发现与鉴定

一、研究背景与意义

球虫（Coccidia）是广泛感染雀形目（Passeriformes）鸟类的重要寄生虫，隶属于顶复门（Apicomplexa）艾美耳科（Eimeriidae），主要包括等孢属（Isospora）和艾美耳属（Eimeria）。这类寄生虫通常感染宿主肠道上皮细胞，可引起肠炎、体重下降、体况恶化甚至死亡，尤其对幼鸟危害显著。部分等孢球虫还可引起系统性肠外感染，即历史上所称的“无孢子虫病”（atoxoplasmosis），其内源性发育阶段可扩散至内脏器官。鉴于其致病潜力与宿主特异性，雀形目鸟类球虫具有重要的兽医与生态学意义。

在日本，已有研究通过粪便检查和寄生虫学调查报道了多种野生鸟类的球虫，但本土雀形目鸟类的球虫区系研究仍十分不足，仅有少数宿主物种采用了形态学与分子学相结合的综合研究方法。日本雀形目球虫的多样性、宿主范围及分类地位很可能被低估。

灰椋鸟（Spodiopsar cineraceus）分布于亚洲大陆、中国中东部和东北部、朝鲜半岛及西伯利亚东南部，在日本大部分地区为留鸟，广泛分布于城乡环境，常形成数百至数千只的大型群栖。尽管该物种数量丰富且与人类改造的栖息地密切相关，但关于其感染球虫的信息极为匮乏，此前尚无任何球虫通过形态学与分子数据相结合的方式从该宿主中得到完整鉴定。本研究旨在通过形态学和分子分析，对日本灰椋鸟中检测到的球虫进行特征描述并确定其分类地位。

二、研究内容与主要结论

研究人员在东京都武藏野市和神奈川县秦野市两地采集灰椋鸟粪便样本，通过形态学观察和分子系统学分析，发现并描述了一个球虫新种——Isospora muku n. sp.。该新种是首次从灰椋鸟属（Spodiopsar）宿主中描述的球虫物种。形态学上，其卵囊呈球形至近球形，平均大小为23.1 × 22.2 μm，具有双层卵囊壁，无微孔和卵囊残体，极粒仅见于部分卵囊；孢子囊呈卵圆形，具有斯泰达体、亚斯泰达体和孢子囊残体。分子数据显示，该新种在MAVCOX1和MARI两个线粒体位点上具有独特序列，与最近的近缘种I. superbusi的遗传距离分别为1.30%和0.14%。系统发育分析表明，来自椋鸟科的等孢球虫谱系呈多系发生，与其他雀形目家族的等孢球虫相互交错，提示宿主转换可能在等孢球虫的多样化中发挥了重要作用。该研究为理解雀形目鸟类球虫的多样性和进化提供了新见解。

三、关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：光学显微镜形态学观察（含微分干涉相差显微镜和图像采集系统）；单个卵囊DNA提取技术；三个非重叠线粒体位点的PCR扩增与Sanger双向测序；BLASTn序列比对；MAFFT多序列比对；MEGA12计算成对未校正p-距离；IQ-TREE构建最大似然系统发育树。样本来源为日本东京都武藏野市和神奈川县秦野市两处灰椋鸟群栖树下地面采集的粪便样本。

四、研究结果

4.1 分类学概要

研究人员通过形态学测量与描述，确立了新种Isospora muku n. sp.的分类学地位。卵囊球形至近球形，23.1 × 22.2（21.1–25.8 × 20.0–24.2）μm，L/W比值1.04；卵囊壁双层，厚1 μm，光滑；无微孔和卵囊残体；极粒偶见（40个卵囊中4个）。孢子囊两个，卵圆形，16.4 × 10.3（12.8–20.5 × 8.9–12.2）μm；具斯泰达体（结节状）和亚斯泰达体（圆形）；无副斯泰达体；孢子囊残体致密。每个孢子囊含4个子孢子，各具一个后部和一个前部折光体及细胞核。模式产地为日本东京都武藏野市，其他产地为神奈川县秦野市。感染部位未知，卵囊从粪便样本中获得。外源性孢子化，采集后3天内完成孢子化。检出率为6/6（100%）粪便样本。模式标本（photosyntypes）保藏于东京目黑寄生虫博物馆（MPM Coll. Nos. 25616a和25616b），序列已提交至日本DNA数据银行（DDBJ），登录号为LC959015（MAVCOX1）、LC959016（COIBF）和LC959017（MARI）。ZooBank注册号为592ED739-D7D6-4F28-8281-6C5D76F8BCE9。种名muku源自灰椋鸟的日语别名。

4.2 序列分析

研究人员从6个单卵囊中提取DNA，在MAVCOX1和COIBF位点获得3个卵囊的PCR产物，在MARI位点获得2个卵囊的PCR产物，所有产物均成功测序。不同卵囊在各位点的序列完全一致。BLASTn搜索显示，MAVCOX1（587 bp）、COIBF（259 bp）和MARI（718 bp）序列均与Isospora属物种最为相似，确认了属级分类地位。MAVCOX1序列与GenBank中任何现有条目均无100%匹配，为新颖序列，与来自加拿大紫辉椋鸟（Lamprotornis superbus）的I. superbusi（KT203396）相似度最高（99.0%）。COIBF序列与多个雀形目Isospora序列100%一致，分辨率不足，仅用于确认属级归属。MARI序列同样无100%匹配，与I. superbusi相似度最高（99.72%）。MAVCOX1位点成对p-距离分析显示，新种与I. superbusi和I. greineri均为1.30%，与未鉴定Isospora sp.序列的距离范围为0.43%–5.84%。MARI位点与8个已命名Isospora物种的距离范围为0.14%–1.99%。最大似然系统发育树显示，I. muku n. sp.在MAVCOX1位点位于一个高支持率支系中（SH-aLRT/UFBoot = 99.5/100），包含I. superbusi、I. greineri、I. similisi及来自椋鸟科、雀科、织布鸟科和戴菊科的未鉴定Isospora spp.，但支系内部关系大多未解决。在MARI位点，新种位于一个包含I. greineri、I. superbusi及来自爪哇八哥和家麻雀的Isospora sp.的支系中（SH-aLRT/UFBoot = 93.7/94）。两个树中，椋鸟科宿主的Isospora均呈多系发生。

五、讨论与结论

目前已有11个命名Isospora物种从椋鸟科宿主中描述。椋鸟科等孢球虫的卵囊形态高度保守，多数物种具有相似大小的球形至近球形卵囊，缺乏微孔和卵囊残体，具有斯泰达体、亚斯泰达体和孢子囊残体。I. greineri和I. superbusi是形态学上无法区分的典型例子，仅通过序列数据得以分离。因此，仅凭形态学难以解决该组的物种边界问题。此外，大多数从印度描述的物种仅有简短的形态学描述而缺乏序列数据，其分类地位无法按当前标准评估，需要从模式宿主重新描述并补充分子数据。

I. muku n. sp.与其最近命名近缘种I. superbusi和I. greineri的遗传距离与这两个已确认为不同物种之间的遗传距离相当，表明该分歧反映种间而非种内变异。然而，雀形目Isospora物种间的线粒体距离总体较小，尚未建立物种界定的分歧阈值，因此仅凭分子数据不足以确立新种。研究人员基于独特的宿主属、独特的地理区域和两个线粒体位点的独特序列相结合来认定I. muku n. sp.。该新种与来自加拿大的I. superbusi的密切关系，以及其与来自不同雀形目家族的Isospora spp.的聚类，表明密切相关的等孢球虫谱系存在于地理上遥远且分类上多样的宿主中。椋鸟科宿主的Isospora呈多系发生，不支持与椋鸟科宿主的严格共分化，提示宿主转换对雀形目等孢球虫的多样化有所贡献。

极粒仅在40个卵囊中的4个（10%）中观察到，被研究人员视为种内变异。但由于卵囊是在体视显微镜下挑取的，无法观察到极粒，不能完全排除具极粒卵囊代表第二个形态相似物种的可能性。由于研究材料仅为粪便，无法确定I. muku n. sp.是否具有肠外感染阶段。

结论：形态学和分子数据表明，来自灰椋鸟的球虫与已知椋鸟科Isospora物种不同，被描述为新种Isospora muku n. sp.。这是首次从灰椋鸟属宿主中描述的球虫物种，也是日本本土雀形目鸟类球虫综合鉴定的重要进展，为理解雀形目等孢球虫的宿主特异性和进化模式提供了新的数据支持。