GmCRF1-like2经XTH介导的细胞壁重塑正向调控大豆疫霉根腐病抗性

《Food and Energy Security》：GmCRF1-like2 Positively Regulates Resistance to Phytophthora sojae Through XTH-Mediated Cell Wall Remodeling

　　

由大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆疫霉根腐病对全球大豆（Glycine max）生产构成重大威胁。APETALA2/乙烯应答因子（AP2/ERF）转录因子在植物免疫调控中发挥关键作用，但其中细胞分裂素反应因子（CRF）亚家族在大豆抗病中的功能在很大程度上仍未被探索。本研究中，表达分析显示，GmCRF1-like2受大豆疫霉侵染显著诱导，且在抗病品种绥农10中的表达水平明显高于感病品种东农50。发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的毛状根转化表明，过表达GmCRF1-like2显著增强对大豆疫霉的抗性，而RNA干扰介导的沉默则增加大豆的感病性。过表达株系的转录组分析鉴定出6892个差异表达基因，京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示显著富集于“苯丙烷生物合成”和“植物-病原互作”通路。重要的是，包括GmXTH31、GmXTH34、GmXTH44和GmXTH49在内的四个木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（XTH）家族基因显著上调。RT-qPCR验证证实，GmCRF1-like2正向调控这些XTH基因的表达，这可能通过木葡聚糖修饰参与细胞壁重塑以响应大豆疫霉。因此，研究人员提出，GmCRF1-like2通过转录激活XTH基因家族，触发细胞壁重塑并增强植物抗性，从而介导大豆对大豆疫霉的防御。该研究揭示了CRF转录因子通过细胞壁修饰调控植物抗病性的潜在分子机制，为改良大豆抗病性提供了潜在靶点。

大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆疫霉根腐病严重威胁全球大豆（Glycine max）生产。植物与病原微生物长期共进化形成了多层免疫防御体系，转录因子作为信号调控核心，在感知病原入侵后迅速激活下游防御基因。APETALA2/乙烯应答因子（AP2/ERF）转录因子家族在植物免疫调控中作用广泛，但其中细胞分裂素反应因子（CRF）亚家族在大豆抗病中的功能尚不清楚。已有研究多集中于ERF对激素信号、病程相关基因和次生代谢的调控，而CRF对细胞壁重塑基因（如木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶，XTH）的调控关系仍属空白。XTH介导的细胞壁重塑是植物物理免疫的重要组分，但其上游转录调控机制不明。为此，研究人员聚焦大豆中的GmCRF1-like2基因，探究其是否通过调控XTH基因表达来影响大豆对大豆疫霉的抗性。

研究人员首先通过表达分析发现，GmCRF1-like2在大豆疫霉侵染后被显著诱导，且在抗病品种绥农10（SN10）中的表达水平显著高于感病品种东农50（DN50）。通过发根农杆菌介导的毛状根转化获得过表达（OE）和RNA干扰（RNAi）系，接种大豆疫霉后进行表型与病原生物量测定。转录组测序（RNA-seq）分析过表达系与空载体（EV）的差异表达基因，并结合RT-qPCR验证关键XTH基因的表达变化。最终提出GmCRF1-like2通过转录激活XTH基因家族、触发细胞壁重塑来增强大豆抗性的工作模型。该研究首次将CRF亚家族与XTH依赖的细胞壁物理免疫联系起来，拓展了对AP2/ERF转录因子调控大豆抗卵菌病害机制的理解，并为大豆抗病改良提供了候选靶点。

关键的技术方法包含：选用大豆抗病品种SN10和感病品种DN50作为材料；利用发根农杆菌K599介导的毛状根转化构建GmCRF1-like2过表达和RNAi系；接种大豆疫霉Race 1游动孢子（约1×10⁵孢子/mL）进行抗性表型及病原生物量测定；对OE和EV毛状根进行转录组测序，用DESeq筛选差异表达基因（DEGs）并进行KEGG富集分析；通过多序列比对和三维结构预测分析CRF1蛋白的进化特征；使用RT-qPCR验证基因表达。

研究结果如下：

3.1 链形植物中CRF1蛋白的进化分析：通过多序列比对和三维结构预测发现，CRF1蛋白的AP2/ERF结构域在从藻类、苔藓到被子植物中高度保守；核定位信号（NLS）基序在维管植物中保守，但在苔藓和藻类中发生分化；被子植物中CRF1蛋白序列更长，且三维结构更相似。

3.2 GmCRF1-like2在抗感品种间的表达差异：利用RT-qPCR检测接种大豆疫霉后0–72小时抗病品种SN10和感病品种DN50中GmCRF1-like2的表达，发现该基因在9小时表达达峰，且SN10中的表达显著高于DN50，在12、24、36和72小时也存在显著差异，表明其参与大豆对大豆疫霉的防御响应。

3.3 GmCRF1-like2正调控大豆对大豆疫霉的抗性：通过发根农杆菌介导的毛状根转化获得GmCRF1-like2过表达和RNAi系，接种大豆疫霉后，过表达系发病程度显著轻于空载体对照，病原生物量（以大豆疫霉Actin基因表达衡量）显著降低；RNAi系则发病更重、病原生物量更高，证明该基因正向调控大豆对大豆疫霉的抗性。

3.4 GmCRF1-like2调控的防御反应涉及苯丙烷生物合成：转录组测序分析显示，过表达系与空载体对照相比共有6892个差异表达基因，其中3866个上调、3026个下调；KEGG富集分析显著富集于“植物-病原互作”“苯丙烷生物合成”和“MAPK信号通路”；其中GmXTH31、GmXTH34、GmXTH44和GmXTH49显著上调。

3.5 CRF1-like2诱导XTH基因表达并提出响应模型：RT-qPCR验证表明，过表达系中上述四个XTH基因表达显著升高，RNAi系中显著降低，确认GmCRF1-like2正调控这些XTH基因的表达。据此提出工作模型：GmCRF1-like2被大豆疫霉诱导后，转录激活XTH基因家族，催化木葡聚糖重排和细胞壁重塑，从而增强大豆抗性。

讨论部分指出，已知多数ERF转录因子通过激活苯丙烷木质素合成、过氧化物酶或病程相关基因来增强抗性，而GmCRF1-like2优先上调用于木葡聚糖修饰的XTH基因，显示其调控机制存在差异。但GmCRF1-like2与GmXTH的直接调控关系尚未通过染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）、酵母单杂交（Y1H）和凝胶迁移实验（EMSA）等验证，且毛状根系统仅反映根部局部防御反应，全株系统抗性需通过稳定转基因大豆加以验证。XTH基因在植物-病原互作中具有环境依赖性双重功能，而在本研究中四个XTH均对抗性发挥正作用。

研究结论：GmCRF1-like2通过转录激活XTH基因家族，触发细胞壁重塑，从而正向调控大豆对大豆疫霉（Phytophthora sojae）的抗性。该研究揭示了CRF转录因子通过细胞壁修饰调控植物抗病性的潜在分子机制，为大豆抗病性改良提供了理论依据和候选靶点。