中性粒细胞STING信号促进心肌缺血再灌注后炎症消退的机制研究

《JACC: Basic to Translational Science》：STING-Expressing Neutrophils Facilitate Resolution of Inflammation After Myocardial Ischemia Reperfusion

缺血性心脏病是全球首要死因，常表现为心肌梗死，其特征是冠状动脉血流阻塞导致缺血、组织损伤和心肌细胞死亡。矛盾的是，心肌梗死后恢复缺血心脏的血流会导致心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤。MI/R通过多种机制造成损害，包括活性氧介导的氧化应激、细胞死亡通路的激活以及炎症免疫反应。因此，这些过程共同成为改善MI/R后心功能的理想靶点。研究人员旨在探究中性粒细胞特异性STING在MI/R损伤发展中的作用。研究发现，与野生型小鼠相比，中性粒细胞特异性STING敲除（neuSTING KO）小鼠表现出先天性炎症反应的消退延迟，并随后导致更严重的心脏损伤。机制上，研究人员发现表达STING的中性粒细胞在驱动巨噬细胞向修复表型极化中发挥关键作用，这是再灌注后炎症消退和MI/R损伤最小化所需的关键转变。这些发现强调了心脏浸润性中性粒细胞的功能多样性，并突显了传统上被视为有害的中性粒细胞功能在愈合过程中的关键作用。

研究背景与科学问题

缺血性心脏病是全球首要致死原因，其常见表现形式为心肌梗死，核心病理机制在于冠状动脉血流阻塞引发心肌缺血、组织损伤乃至心肌细胞死亡。然而，临床治疗中恢复缺血区域血供的过程——即心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion, MI/R）——本身会诱发继发性损伤，称为MI/R损伤。MI/R损伤的机制复杂，涉及活性氧介导的氧化应激、细胞死亡通路激活以及剧烈的炎症免疫应答。既往针对炎症反应的免疫靶向疗法，如秋水仙碱和卡那奴单抗，虽能降低MI/R后的心血管事件，但其疗效被感染风险增加所抵消，且未能显著改善生存率。因此，深入理解MI/R中免疫介导损伤的分子和细胞靶点，对于开发更有效的干预策略至关重要。

在MI/R过程中，濒死心肌细胞释放的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）触发强烈的炎症级联反应，其中中性粒细胞的快速动员和浸润是炎症起始的标志。中性粒细胞在MI/R中扮演着复杂的双重角色：一方面它们清除坏死细胞和基质碎片，促进修复；另一方面，过度活跃的中性粒细胞通过产生活性氧、蛋白水解酶和中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）造成进一步损伤。研究表明，早期中性粒细胞反应可影响后续炎症细胞的招募、活化和行为，最终决定炎症的轨迹和消退。干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）是I型干扰素转录的关键调控因子，在中性粒细胞中虽有较低表达，但足以诱导免疫反应。然而，此前的研究多依赖全局抑制剂或全身敲除模型，对中性粒细胞特异性STING功能的表征尚不充分。因此，研究人员旨在探究中性粒细胞特异性STING在MI/R损伤发展中的具体作用。

研究方法与技术路线

研究人员采用的主要关键技术方法包括：

1. 1.
   动物模型构建：利用Ly6G启动子驱动Cre重组酶的Catchup小鼠品系与STING^flox小鼠杂交，生成中性粒细胞特异性STING敲除（neuSTING KO）小鼠及其同窝野生型（WT）对照。
2. 2.
   人类样本分析：采集20例健康男性和20例健康女性供者的静脉血，通过阴性免疫磁珠分选分离中性粒细胞进行常规批量mRNA测序；同时利用已发表数据集，对急性心肌梗死后2天的人类左心室梗死区及对照样本进行空间转录组学分析。
3. 3.
   小鼠MI/R模型：对C57BL/6J小鼠实施60分钟缺血后24小时再灌注，收集心脏组织用于免疫组化和流式细胞术分析。
4. 4.
   单细胞RNA测序：对MI/R后24小时的小鼠心脏非心肌细胞群体进行单细胞RNA测序，分析不同细胞亚群的转录特征。
5. 5.
   功能检测：评估中性粒细胞钙离子内流、NETs形成、脱颗粒标志物、吞噬作用和活性氧产生等效应功能；通过TUNEL染色、Annexin V染色及胞内Ly6G染色等方法评估中性粒细胞凋亡和巨噬细胞胞葬作用。

研究结果

1. 1.
   STING在MI/R损伤后人源和小鼠中性粒细胞中被激活
   人类中性粒细胞表达STING通路相关基因的mRNA转录本。空间转录组学分析显示，高表达STING的中性粒细胞定位于心肌梗死后的缺血区域，且来自缺血区、边界区和远隔区的中性粒细胞STING表达均高于对照心脏。小鼠模型中，MI/R后24小时心脏内磷酸化STING（pSTING⁺）和磷酸化TBK1（pTBK1⁺）中性粒细胞比例显著增加，磷酸化IRF3（pIRF3⁺）中性粒细胞的数量和表达水平也显著升高。
2. 2.
   中性粒细胞STING缺失加重MI/R后心脏损伤
   neuSTING KO小鼠血清心肌肌钙蛋白I在再灌注24小时无显著差异，表明初始心肌细胞死亡未受影响。但在再灌注后14天，neuSTING KO小鼠左心室收缩末期直径和舒张末期直径显著增大，射血分数和缩短分数显著降低，心室重量与胫骨长度比增加，左心室纤维化显著增多，血清NT-proBNP水平升高，表明心脏功能恶化。雌性小鼠中未观察到上述差异。
3. 3.
   中性粒细胞STING缺失增加MI/R后心脏I型干扰素水平
   neuSTING KO小鼠心脏组织中Ifna1和Ifnb1 mRNA转录本升高，而Tnf和Il6水平不变。neuSTING KO小鼠心脏中性粒细胞中pIRF3阳性的百分比和平均荧光强度均降低，但心肌细胞中pIRF3水平上调，提示心肌细胞中STING活化增强。
4. 4.
   单细胞RNA测序揭示neuSTING KO中性粒细胞炎症信号减弱
   单细胞测序鉴定出7个中性粒细胞亚群。与WT相比，neuSTING KO小鼠中与NFκB信号转导相关的促炎亚群（簇3和簇5）比例显著减少，而代表紧急粒细胞生成的簇1比例增加。差异基因表达分析显示NFκB信号和TNF产生调节通路下调，氧化磷酸化和STAT5信号通路上调。
5. 5.
   中性粒细胞STING缺失损害MI/R后心脏中性粒细胞效应功能
   neuSTING KO中性粒细胞钙离子内流减少，NETs形成减少，CD63（初级颗粒脱颗粒标志物）表达降低，对大肠杆菌颗粒的吞噬作用减弱，细胞内活性氧水平降低。
6. 6.
   中性粒细胞STING缺失削弱MI/R后中性粒细胞向心脏的招募
   再灌注后第1天，neuSTING KO小鼠心脏中白细胞、髓系细胞和中性粒细胞数量显著减少。CXCR2⁺中性粒细胞减少，而CXCR4⁺中性粒细胞在第1天和第3天均增加。血液中也观察到类似模式。趋化作用特征评分在neuSTING KO中性粒细胞中显著降低。
7. 7.
   中性粒细胞STING缺失减少MI/R后心脏中性粒细胞凋亡和胞葬作用
   neuSTING KO小鼠心脏中TUNEL阳性中性粒细胞和Annexin V阳性中性粒细胞显著减少，CD47（“别吃我”信号）表达升高。再灌注后第3天，MertK⁺巨噬细胞减少，巨噬细胞胞内Ly6G染色降低，表明胞葬作用受损。体外实验证实neuSTING KO中性粒细胞凋亡减少且不易被巨噬细胞吞噬。
8. 8.
   中性粒细胞STING缺失削弱MI/R后单核细胞招募和巨噬细胞向抗炎表型的极化
   再灌注后第3天，neuSTING KO小鼠心脏中总CD64⁺细胞和抗炎（CD206⁺）巨噬细胞数量显著减少，促炎（CD206^?）巨噬细胞比例升高。CCR2⁺单核细胞来源的巨噬细胞数量减少。单核细胞招募特征评分在neuSTING KO中性粒细胞中显著降低。单细胞分析显示neuSTING KO巨噬细胞呈现更强的促炎转录谱，且应激相关亚群（簇5）扩增。

总结与讨论

本研究首次揭示了中性粒细胞特异性STING在MI/R损伤中的保护性作用。研究人员发现，STING在中性粒细胞中的表达并非传统认知中的单纯促炎因子，而是促进炎症消退和心脏修复的关键分子。机制上，STING表达的中性粒细胞通过维持正常的效应功能（如NETs形成、脱颗粒、吞噬和ROS产生）、促进自身凋亡、降低CD47“别吃我”信号，从而有效被巨噬细胞胞葬。这一过程进而驱动巨噬细胞从促炎表型向抗炎/修复表型极化，最终促进炎症消退和心脏功能恢复。相反，中性粒细胞STING缺失导致中性粒细胞凋亡减少、胞葬障碍、巨噬细胞极化受阻，使得心脏内炎症持续存在，加重不良重构。

研究结论：中性粒细胞表达的STING在MI/R损伤后促进心脏修复中发挥关键作用。STING缺陷的中性粒细胞表现出效应功能受损、凋亡减少和胞葬障碍，导致巨噬细胞无法有效极化为修复表型，最终加剧心脏损伤。这些发现挑战了将中性粒细胞功能简单视为有害的传统观点，揭示了中性粒细胞在心脏愈合中的关键保护作用，并为开发针对MI/R损伤的更精准免疫调节策略提供了新的潜在靶点。