《Journal of Advanced Research》：From discovery to engineering: revealing and optimizing the indigoids biosynthesis by FMO from
Indigofera tinctoria
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研究人员从传统药用和染料植物*Indigofera tinctoria*（木蓝）中鉴定并功能表征了三个基因（ItFMO、ItTSA和ItINS），该植物的生物合成途径尚未在酶水平上阐明。ItFMO较其他已测试的植物FMO表现出更高的催化效率（kcat/Km =
研究人员从传统药用和染料植物*Indigofera tinctoria*（木蓝）中鉴定并功能表征了三个基因（ItFMO、ItTSA和ItINS），该植物的生物合成途径尚未在酶水平上阐明。ItFMO较其他已测试的植物FMO表现出更高的催化效率（kcat/Km = 0.22 ± 0.05 s-1*mM-1），并具有广泛的底物宽泛性，可将16种取代吲哚转化为颜色各异的靛蓝类色素（indigoids）。ItFMO通过吲哚酚（indoxyl）与2-羟吲哚（2-oxindole）缩合，以较高比例（约70%）共产生靛玉红（indirubin），并可通过共表达和共培养策略进行工程化改造以提高靛蓝类色素产量。分子动力学（MD）模拟和丙氨酸扫描揭示ItFMO采用"整体稳定、局部灵活"的构象动态特征，其中六个关键残基（Q51、Y160、K212、S213、F373和N427）共同调控其催化活性。
**研究背景与问题**
靛蓝（indigo）作为一种历史悠久的天然色素，在传统中医药和印染工业中具有双重应用价值。青黛（Qingdai）作为清热类中药，其主要植物来源包括*Indigofera tinctoria*（豆科）、*Strobilanthes cusia*（爵床科，南板蓝根基原植物）、*Isatis indigotica*（十字花科，板蓝根基原植物）和*Polygonum tinctorium*（蓼科）。然而，当前超过90%的工业靛蓝生产（约80,000吨/年）依赖石化来源的苯胺及甲醛、氰化氢等有毒试剂，环境代价巨大，亟需可持续的生物制造替代方案。
生物合成途径中，含黄素单加氧酶（flavin-containing monooxygenase，FMO）和细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）催化吲哚羟基化，这是靛蓝形成的关键步骤。FMO以黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）为辅基、以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）为电子供体，催化氧原子插入底物。细菌FMO（如mFMO、CgFMO）已被广泛表征，工程化改造后滴度超过1.31 g/L。然而，这些进展几乎完全来自微生物酶，其底物范围相对有限。植物FMO属于大型多样化基因家族，特定分支（如Clade I）与病原防御相关。研究团队此前已鉴定并功能表征了*S. cusia*中的ScFMO和*I. indigotica*中的IiFMO作为植物靛蓝生物合成中的吲哚酚合酶。值得注意的是，序列比较揭示细菌FMO的保守NADPH结合基序为GXXYSA（含关键酪氨酸），而所有三个已表征的植物靛蓝FMO均携带GXXKSA，暗示植物FMO具有根本不同的催化结构框架，但这一假设尚未被验证。
基于此，研究人员假设植物FMO具有区别于细菌FMO的催化特性，并根植于不同的结构框架。为验证此假设，研究人员从*I. tinctoria*中鉴定并功能表征了关键FMO，系统比较了其与已表征植物FMO的催化特性，并通过MD模拟和突变揭示了其活性的结构基础。
**关键技术方法**
研究人员首先对*I. tinctoria*转录组（NCBI SRA180766）进行de novo组装，以ScFMO为查询序列进行本地BLASTP搜索（E-value = 0.0001），结合序列完整性（≥450个氨基酸）和保守FMO基序（FAD结合基序GXGXXG、FAD识别基序FXGXXXHXXDY、NADPH结合基序GXXKSG/A）筛选候选基因。同时，以Pfam数据库中TSA结构域（PF00290）的HMM профиль为种子进行HMMER搜索鉴定IGL候选基因。候选基因经密码子优化后克隆至pET28a载体，在*Escherichia coli* BL21(DE3)中异源表达，通过HPLC检测靛蓝产生或IGP转化为吲哚的能力进行功能验证。酶动力学参数通过HPLC底物消耗法测定，拟合Michaelis-Menten方程。亚细胞定位通过GFP融合蛋白在*Nicotiana benthamiana*叶片中的瞬时表达观察。分子对接采用Glide标准精度模式，以mFMO晶体结构（PDB: 2XVJ）为模板，植物FMO结构由AlphaFold 3预测。MD模拟在Desmond模块中进行，轨迹时长200 ns。基于FADOOH-吲哚对接模型，对吲哚结合位点5 ?半径内的残基进行丙氨酸扫描突变，构建8个突变体（Q51A、Y160A、Y189A、K212A、S213A、F373A、N427A单突变体及K212A-S213A双突变体）。工程化改造采用pCOLA Duet双表达载体共表达ItFMO与ItTSA、ItINS或TnaA，以及ItFMO与TnaA分株共培养策略。
**研究结果**
**ItFMO、ItTSA和ItINS的鉴定与功能筛选**：研究人员从*I. tinctoria*转录组中检索到18个FMO候选序列，经筛选后获得一个具有稳健靛蓝形成活性的序列，命名为ItFMO（GenBank accession PV744352），其编码522个氨基酸，理论等电点7.88，与ScFMO、PtFMO和IiFMO的氨基酸序列一致性分别为54.2%、41.4%和39.9%。系统发育分析将ItFMO与已报道的植物靛蓝FMO归入Clade I。通过HMMER搜索获得4个IGL候选基因，经系统发育和多序列比对鉴定出ItTSA（GenBank PV744353）和ItINS（GenBank PV744354），分别编码312和267个氨基酸。酶学 assay 证实两者均具有IGP裂解酶活性。亚细胞定位显示ItTSA定位于叶绿体，而ItFMO和ItINS定位于细胞质，表明*I. tinctoria*中吲哚生物合成通过细胞质与叶绿体的协调活动完成。
**ItFMO的底物宽泛性**：当向ItFMO发酵液中添加2-羟吲哚时，同时产生靛蓝和靛玉红，定量分析显示靛玉红约占总色素产量的70%。以4/5/6/7-氟吲哚、4/5/6/7-硝基吲哚、4/5/6/7-氨基吲哚和4/5/6/7-甲氧基吲哚为底物，所有反应均产生颜色各异的色素（紫色、湖蓝色及不同深浅的棕色），证实成功形成靛蓝衍生物。
**ItFMO及其同源物的酶动力学表征**：以0.8 mM色氨酸为底物，ItFMO在24 h产生37.67 ± 5.90 mg/L靛蓝，显著高于ScFMO（7.93 ± 0.53 mg/L）和IiFMO（0.26 ± 0.20 mg/L）；48 h时产量稳定在41.44 ± 2.03 mg/L。稳态动力学参数显示ItFMO的kcat/Km为0.22 ± 0.05 s
-1*mM
-1，高于ScFMO（0.19 ± 0.05 s
-1*mM
-1）和IiFMO（0.09 ± 0.05 s
-1*mM
-1）的2.4倍；ItFMO对吲哚的Km（0.57 ± 0.13 mM）低于ScFMO（1.23 ± 0.29 mM）和IiFMO（6.15 ± 2.79 mM），表明更高的底物亲和力。序列和二级结构分析鉴定出三个保守结构域：FAD结合域、FAD识别域和NADPH结合域。ItFMO含18个β-链和18个α-螺旋，关键基序包括FAD识别序列FKGRVMHSMDY（残基178-188）、FAD结合基序GAGISG（残基9-14）和NADPH结合基序GSQKSG（残基209-214）。
**ItFMO及其同源物的分子动力学模拟**：分子对接揭示吲哚与NADPH在活性位点存在显著空间位阻，支持分步催化机制：静息态中NADPH结合FAD并传递电子后以NADP
+形式解离；活化态中吲哚占据活性位点进行FAD介导的氧化。MD模拟显示活化态下ItFMO具有最低的平均RMSD（1.82 ± 0.27 ?），且是唯一在活化后RMSD降低的变体（Δ = –0.61 ?），而ScFMO、PtFMO和IiFMO均显示RMSD升高。局部构象动力学方面，静息态下ItFMO具有最低的平均RMSF（9.07 ± 1.36 ?），活化后RMSF增加36%至12.30 ± 2.72 ?，表明关键活性位点区域获得底物配位所需的柔性。结合自由能分解显示ItFMO在活化态具有较低的结合亲和力（ΔGMMGBSA = -24.23 ± 0.12 kcal/mol），可能反映瞬时而高效的辅因子交换。
**丙氨酸扫描突变鉴定调控ItFMO催化的多个关键残基**：突变结果显示Y160A和K212A活性降低最为严重，分别仅保留野生型活性的1.3%和1.5%（P < 0.0001）；Q51A保留4.8%，K212A-S213A双突变体保留3.1%；N427A保留48.6%，F373A保留15.0%，S213A保留33.3%；Y189A保留86.5%，差异无统计学意义（P = 0.055）。这些结果确认多个空间分布的残基共同调控ItFMO的催化效率，关键残基Q51、Y160、K212、S213、F373和N427提供了ItFMO活性位点的功能图谱。
**通过共表达和共培养策略工程化靛蓝生产**：在共表达系统中，pCOLA Duet-ItFMO-TnaA产生最高靛蓝滴度（41.27 ± 0.84 mg/L），较ItFMO单培养对照（27.58 ± 0.19 mg/L）提高1.5倍（P < 0.0001）；pCOLA Duet-ItFMO-ItINS产生30.54 ± 0.33 mg/L；pCOLA Duet-ItFMO-ItTSA仅产生5.68 ± 0.20 mg/L。生长曲线分析排除了生长抑制作为ItTSA共表达系统产量降低的原因。共培养策略中ItFMO和TnaA分株以1:1体积比共培养，48 h后产生60.03 ± 0.82 mg/L靛蓝，较单培养提高2.7倍。结果表明：TnaA是*E. coli*中与ItFMO共表达的最有效吲哚供体；ItTSA虽在体外具有确认的酶活性，但不适合*E. coli*共表达系统；通过共培养物理分离吲哚生成模块和吲哚氧化模块可缓解限制单株产量的代谢约束。
**讨论与结论**
讨论部分首先阐述了植物与细菌FMO的结构框架差异。细菌FMO中保守酪氨酸稳定NADP
+结合和过氧黄素中间体，而所有四个植物靛蓝FMO中GXXYSA被GXXKSA替代，赖氨酸占据关键酪氨酸位置。这一基序分化可能降低NADP(H)结合稳定性或改变结构域动力学，与分步催化机制一致。其次，讨论了ItFMO高催化效率的结构与构象动力学基础：ItFMO在活化态具有最低RMSD且是唯一活化后RMSD降低的变体，静息态具有最低RMSF，活化后RMSF适度增加36%，实现了整体稳定性与局部柔性的有利平衡，与其较低的Km和较高的kcat/Km一致。植物FMO倾向于"高亲和力"策略，而细菌FMO倾向于"高周转"策略，这反映了不同的选择压力。丙氨酸扫描验证了计算预测，鉴定了Q51、Y160、K212、S213、F373和N427为关键残基。关于催化多样性与工程化前景，ItFMO将16种取代吲哚转化为颜色各异的靛蓝类色素，展示广泛的底物宽泛性；吲哚酚作为分支点中间体，二聚化产生靛蓝，与2-羟吲哚缩合产生靛玉红（约70%），为靛玉红生成提供了高产比例替代途径。然而，*E. coli*中实现的靛蓝滴度仍显著低于优化细菌FMO系统，可能反映植物酶在*E. coli*宿主中的不相容性，包括亚优化折叠、辅因子相互作用或底物可及性。植物酶常需真核 chaperone、翻译后修饰或特定亚细胞区室化，而*I. tinctoria*中吲哚代谢的天然区室化（ItTSA在叶绿体，ItFMO/ItINS在细胞质）无法在细菌中重建，因此替代宿主底盘如*Saccharomyces cerevisiae*或植物基系统值得未来考虑。
研究结论部分翻译如下：本研究全面表征了*I. tinctoria*中参与吲哚生物碱生物合成途径的三个基因（ItFMO、ItINS、ItTSA）。其中，ItFMO是含黄素单加氧酶，催化吲哚转化为吲哚酚，这是靛蓝类色素生物合成的关键步骤。动力学分析、MD模拟和丙氨酸扫描揭示ItFMO较其他已测试植物FMO具有更高的催化效率，具有独特的构象特征和多个调控其活性的关键残基（Q51、Y160、K212、S213、F373和N427）。ItFMO还表现出广泛的底物宽泛性和通过吲哚酚与2-羟吲哚缩合高效共产生靛玉红（约占总色素70%）的能力。通过共表达和共培养在*E. coli*中的工程化努力实现了滴度提高，但仍低于优化的细菌系统，凸显了需要更适合植物来源酶的替代宿主。总体而言，本研究为理解FMO介导的靛蓝形成提供了机制基础，并为未来工程化植物来源酶以实现可持续天然色素生产提供了结构见解。
