雌激素驱动的PDK4-MYH9磷酸化促进间充质干细胞线粒体分裂与成骨定向

《Journal of Advanced Research》：Estrogen-driven PDK4-MYH9 phosphorylation promotes mitochondrial fission and osteogenic commitment of mesenchymal stem cells

雌激素驱动的PDK4-MYH9磷酸化促进间充质干细胞（MSCs）线粒体分裂与成骨定向；雌激素受体α（ERα）在MSCs中直接激活PDK4转录；PDK4在丝氨酸1943位点（Ser1943）磷酸化MYH9；MYH9磷酸化驱动动力相关蛋白1（DRP1）介导的线粒体分裂；PDK4过表达可在无雌激素条件下逆转双侧卵巢切除术（OVX）诱导的骨质疏松；PDK4-MYH9轴为无需激素的促骨合成骨质疏松治疗提供潜在靶点。

骨质疏松症（osteoporosis）是以骨量减少、骨微结构退化为特征的全身性骨骼疾病，绝经后骨质疏松症（PMOP）与雌激素水平下降密切相关，全球患者超过2亿，绝经后女性负担最重。雌激素替代治疗长期作为防治基石，经典观点主要强调雌激素通过RANK信号抑制破骨细胞生成，但越来越多证据显示雌激素可直接调控成骨细胞功能；成骨细胞中ERα条件性敲除会降低骨量和骨强度。然而，雌激素是否以及如何调控间充质干细胞（MSCs）这一成骨关键细胞类型仍不清楚。MSCs分化与转录程序、细胞能量状态及细胞器重塑偶联，线粒体通过分裂-融合动态（mitochondrial dynamics）维持功能并调控干细胞命运，线粒体分裂对MSCs成骨分化至关重要，但雌激素是否通过MSCs线粒体动力学调控成骨尚待阐明。作者Gan Zhong等针对该空白开展研究，论文发表于《Journal of Advanced Research》。研究人员整合单细胞转录组、空间转录组、多组学、遗传工程小鼠和生化实验，揭示雌激素-ERα-PDK4-MYH9-DRP1轴：ERα直接激活PDK4转录，PDK4催化MYH9 Ser1943磷酸化，促进DRP1向线粒体募集，诱导线粒体分裂并增强MSCs成骨定向；Pdk4过表达可在无雌激素条件下逆转OVX诱导的骨丢失。该研究将核受体信号与细胞器动力学和干细胞命运连接起来，重新界定PDK4在骨骼系统中的作用，为绝经后骨质疏松症提供了不依赖激素的促骨合成潜在靶点。

方法上，研究人员整合GEO公共数据：GSE147287和GSE169396（6例临床样本）用于单细胞转录组，GSE284089（1例人股骨头）用于空间转录组，GSE252394用于成骨诱导转录组；构建OVX小鼠及E2补充模型、Prx1-Cre;Pdk4^fl/fl条件敲除小鼠和AAV-DSS介导的Pdk4过表达模型；分离原代骨髓间充质干细胞（BMSCs）并进行流式鉴定和三系分化；采用微计算机断层扫描（Micro-CT）、H&E/Masson染色、calcein双标、共聚焦和透射电镜、Seahorse能量代谢分析、CUT&Tag、RNA-seq、Co-IP-LC-MS/MS、GST pull-down及体外激酶实验等。

结果部分：1. MSC功能障碍构成骨质疏松的分子基础：通过整合公共单细胞转录组数据，保留45,184个高质量细胞并鉴定14个簇，其中4,782个基质细胞被重新聚类；GO富集和假时间分析显示骨质疏松MSCs成骨相关通路受损，且线粒体功能相关通路显著富集，提示MSC功能障碍和线粒体异常是骨质疏松的分子基础。2. 雌二醇改善去卵巢小鼠骨微结构并增强骨形成活性：通过OVX小鼠、E2补充、Micro-CT、组织学和calcein双标，发现OVX导致骨小梁丢失、皮质变薄及矿化沉积率（MAR）和骨形成率/骨表面积（BFR/BS）降低，E2补充可恢复骨微结构和成骨活性。3. 雌二醇增强BMSCs成骨程序：通过原代BMSCs、碱性磷酸酶（ALP）活性、茜素红S（ARS）染色、Western blot、qPCR和RNA-seq，发现10 nM E2时间依赖性增强RUNX2、OPN及成骨基因表达，直接促进BMSC成骨分化。4. 雌激素通过特异性驱动DRP1募集至线粒体诱导线粒体分裂：通过MitoTracker、透射电镜、Seahorse和线粒体组分Western blot，发现E2促线粒体碎片化，提高最大呼吸和储备呼吸能力，而不改变基础呼吸、糖酵解和总ATP；E2增加线粒体组分DRP1而不改变总DRP1，且不激活自噬。5. 线粒体分裂是雌激素驱动MSCs成骨分化的重要调控节点：使用DRP1抑制剂Mdivi-1阻断线粒体分裂后，E2诱导的线粒体碎片化、ALP活性、矿化结节和成骨基因上调均被抵消，表明线粒体分裂是E2促成骨的关键节点。6. 整合多组学筛选确定PDK4为雌激素调控成骨分化的关键靶点：整合ERα CUT&Tag、E2处理RNA-seq和成骨转录组，UpSet分析显示Pdk4为唯一重叠基因；CUT&Tag-qPCR证实ERα结合Pdk4启动子含雌激素反应元件（ERE）的区域；E2剂量依赖性上调PDK4，ERα敲低取消该上调；OVX骨组织PDK4降低，E2恢复。7. Pdk4缺失削弱MSCs成骨分化潜能并导致骨质疏松性骨丢失：通过Prx1-Cre;Pdk4^fl/fl小鼠、Micro-CT、组织学、calcein双标及BMSCs实验，发现Pdk4缺失降低骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨密度（BMD）和骨小梁厚度（Tb.Th），增加骨小梁分离度（Tb.Sp）及MAR/BFR降低；BMSCs的ALP、ARS、RUNX2、OPN和成骨基因均降低；人股骨头空间转录组显示PDK4富集于骨代谢微环境，单细胞分析显示骨质疏松MSCs中PDK4下调。8. Pdk4缺失破坏E2-DRP1信号并抑制线粒体分裂：在Pdk4缺失BMSCs中，E2不能诱导线粒体碎片化、不能增强呼吸储备、不能促进DRP1线粒体募集；PDH Ser293磷酸化无一致变化，提示PDK4介导E2-DRP1信号且不依赖经典PDH轴。9. PDK4通过催化MYH9 S1943磷酸化驱动DRP1线粒体募集：通过Co-IP-LC-MS/MS鉴定MYH9，Co-IP、四色免疫荧光和GST pull-down证实PDK4结合MYH9 C端α螺旋；质谱和PDK4抑制剂M77976确定Ser1943依赖PDK4磷酸化；体外激酶实验及S1943A/S1943D突变表明PDK4催化MYH9 S1943磷酸化，S1943D或野生型MYH9联合PDK4增强MYH9和DRP1线粒体募集，S1943A则不能。10. MYH9 S1943磷酸化偶联雌激素信号与线粒体分裂：在Myh9敲低BMSCs中回补MYH9野生型或S1943A突变体，E2可在野生型中诱导线粒体分裂、提高呼吸储备并增强ALP、ARS和成骨基因表达，而S1943A削弱这些效应，表明S1943磷酸化是E2-PDK4轴的分子开关。11. Pdk4过表达足以逆转雌激素缺乏诱导的骨丢失：OVX后经尾静脉给予AAV-DSS-Pdk4，免疫组化证实骨组织过表达且多组织qPCR显示骨组织富集，H&E未见毒性；Micro-CT显示BV/TV、BMD、Tb.N增加、Tb.Sp降低，组织学和calcein显示MAR/BFR增加；血清I型前胶原N端前肽（P1NP）升高而I型胶原C端肽（CTX-1）不变，乳酸和丙酮酸无显著差异，表明PDK4过表达在无外源雌激素条件下增强骨形成而不刺激骨吸收。

讨论部分总结：该研究将ERα-PDK4-MYH9-DRP1轴连接核受体信号、线粒体动力学与MSC成骨定向，支持雌激素不仅抑制骨吸收，也通过MSC促进骨形成。研究强调E2诱导的PDK4上调不导致经典PDH抑制相关的代谢重编程，而是增强呼吸储备、诱导分裂且不激活大规模线粒体自噬；PDK4的非经典激酶作用与MYH9作为连接上游激酶和下游细胞器重塑的枢纽得到突出。原文同时指出局限：公共数据供体数有限，假时间应解释为疾病相关分布；Prx1-Cre模型可能存在发育效应；未进行DRP1遗传验证、 putative ERE功能测试和kinase-dead PDK4细胞救援；碎片化线粒体如何向核传递成骨转录信号尚不清楚；Mdivi-1脱靶和LC3自噬流检测限制使线粒体自噬贡献不能完全排除；AAV介导PDK4过表达的长期安全性仍需评估。研究结论（译）：基于这一新阐明的机制，研究人员提出PDK4和MYH9可作为开发针对绝经后骨质疏松症促骨合成策略的潜在治疗靶点；该策略聚焦于恢复MSC分化能力而非仅抑制骨吸收，提供了一种治疗策略。