《Journal of Advanced Research》：Development and multicenter validation of a cfDNA methylation-based PCR assay (myESCAP) with machine-learning prediction for non-invasive detection of esophageal cancer
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食管癌（esophageal cancer, EC）的早期检测仍面临挑战，导致患者生存率较低。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）上的甲基化修饰已被证明可有效用于血液中的癌症检测。研究人员设计了一种基于PCR
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食管癌（esophageal cancer, EC）的早期检测仍面临挑战，导致患者生存率较低。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）上的甲基化修饰已被证明可有效用于血液中的癌症检测。研究人员设计了一种基于PCR的检测方法，使用11个食管癌特异性甲基化位点作为标志物。该检测方法在超过1000例患者队列中能够准确检测食管癌。
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一、研究背景与目的
食管癌（esophageal cancer, EC）是中国面临的重大健康挑战，约占全球新发病例的44%，其发病率和死亡率在中国所有癌症类型中分别位居第七和第五。食管癌是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，早期（0–II期）5年生存率约为44%，而晚期（III–IV期）则骤降至约13%。然而，早期检测面临巨大困难：食管癌初期常无症状，导致仅约20%的病例在I期或更早阶段被确诊，而此阶段5年生存率可达约60%。
目前，内镜检查是检测食管癌的金标准，但属于侵入性检查，可能引起患者不适和潜在并发症，且依赖专业医疗人员，限制了在食管癌高发但医疗资源欠发达地区的推广。传统影像学方法如计算机断层扫描（computed tomography, CT）难以可靠检测小型或早期肿瘤，且常难以区分良恶性病变。海绵细胞学检测的敏感性和特异性也不理想。因此，亟需开发一种非侵入性、成本效益高的食管癌早期检测方法。
近年来，DNA甲基化已成为食管癌筛查和诊断中颇具前景的生物标志物类别。这种表观遗传修饰涉及向DNA胞嘧啶碱基添加甲基基团，可在不改变DNA序列的情况下改变基因表达。肿瘤细胞基因组中的异常DNA甲基化改变发生在肿瘤发生的起始阶段，通常早于临床症状出现，为癌症早期检测提供了理想标志物。研究人员此前开发了基于靶向甲基化测序的血液多癌种检测方法PanSeer，可识别包括食管癌在内的中国五种最常见癌症类型。对PanSeer数据的进一步分析表明，其中存在对食管癌检测具有高准确性的特异性生物标志物。研究人员假设，通过测试和优化这些标志物，可将其转化为基于PCR的检测形式，开发出成本效益高的食管癌诊断检测方法。
二、研究设计与关键方法
这是一项多中心、回顾性病例对照研究，遵循《赫尔辛基宣言》和药物临床试验管理规范原则，研究方案经三家参与中心（国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院、山西省肿瘤医院、中国科学技术大学附属第一医院）的机构审查委员会批准。研究对象包括经病理确诊的初治食管癌患者（包括高级别上皮内瘤变，high-grade intraepithelial neoplasia, HGIN）、患有良性食管/胃疾病的患者以及无症状个体。研究共纳入489例食管癌病例和555例非恶性对照用于检测开发、模型训练和验证。
关键技术方法包括：从血浆中提取循环游离DNA（circulating free DNA, cfDNA），进行亚硫酸氢盐转化，通过包含11个PCR靶标引物池的预扩增步骤，随后进行TaqMan探针定量PCR（quantitative PCR, qPCR）检测。研究人员利用Ct值作为预测因子，采用六种机器学习方法（广义线性模型、K近邻、C5.0决策树、梯度提升机、随机森林和支持向量机）构建食管癌检测模型，并通过倾向性评分匹配控制年龄和性别混杂因素。
三、研究结果
3.1 研究队列结构
研究在2020年11月至2023年7月期间招募了550例HGIN和食管癌患者，排除非食管癌（胃癌43例、贲门癌4例）、其他器官转移（1例）和入组前已接受治疗（1例）的病例后，保留501例初治食管癌病例用于检测开发。同时招募559例良性食管/胃疾病患者或无症状个体作为非恶性对照。因样本质量差或实验失败移除16例后，最终队列包含489例食管癌病例和555例非恶性对照。
3.2 食管癌标志物和PCR检测开发
研究人员从PanSeer生物标志物面板中选择了11个能稳健区分食管癌来源循环肿瘤DNA（ctDNA）与非恶性对照cfDNA的标志物作为候选PCR靶标。其中涉及的基因包括已知癌基因PRDM14、肿瘤抑制基因CHFR、已知癌症标志物SEPTIN9和SHOX2等。为增强PCR检测准确性，研究人员设计了特异性靶向食管癌ctDNA与非恶性对照cfDNA之间差异甲基化CpG位点的TaqMan探针，并引入了12个循环的预扩增步骤。PCR分析显示，所有11个标志物在食管癌病例与非恶性对照之间均表现出显著差异甲基化，调整后p值范围为5.8×10?3至3.1×10???，单个标志物的曲线下面积（area under the curve, AUC）值最高可达0.79。
3.3 基于PCR结果的食管癌检测模型开发与验证
研究人员使用倾向性评分匹配建立了训练队列，包含349例食管癌患者和347例非恶性对照，两组在年龄和性别比例上无显著差异。六种机器学习模型在训练队列中表现出相似性能，平均AUC为0.835，平均敏感性为76.13%，平均特异性为90.88%。随机森林（random forest, RF）模型表现最为突出，AUC达0.925，但该模型在验证队列中AUC显著下降至0.802，提示存在过拟合问题。验证队列包含142例食管癌患者和206例非恶性对照，六种模型在验证队列中保持了一致的检测准确性，平均AUC为0.823，平均敏感性为75.59%，平均特异性为89%。五种模型（C50、GLM、GBM、KNN和SVM）在训练和验证队列之间保持了稳定的性能，证实了其稳健的泛化能力。所有模型均表现出随食管癌分期进展敏感性逐步增加的趋势，从HGIN和0期的平均31.33%上升至IV期的96.83%。验证队列中，早期（HGIN、0期和I期）敏感性平均为39.58%，而晚期（III期和IV期）敏感性平均达91.67%。
四、讨论与结论
myESCAP检测在验证队列中实现了平均敏感性75.6%和特异性89%的性能，与两种已获国家药品监督管理局（NMPA）批准的甲基化PCR检测方法（MT-1A/Epo/Septin9检测和OTOP2/KCNA3检测）性能相当。该检测的PCR形式相比测序方法具有成本效益优势，仅需标准实验室设备、较低试剂成本和较短周转时间，适合资源有限环境中的大规模筛查。研究人员提出“先血液、后内镜”的策略，将myESCAP作为分流工具，优先对高危个体进行确诊性内镜检查。研究还发现，DNA甲基化标志物相比血清肿瘤标志物、基因突变和片段组学特征等替代标志物具有化学稳定性更高、食管癌缺乏热点突变而甲基化改变更丰富特异、不受潜能不确定的克隆性造血干扰、可开发为低成本易操作的PCR检测等优势。研究局限性包括：需在前瞻性独立研究中验证、11标志物面板需精简至2–3个核心标志物、早期食管癌敏感性相对较低、食管腺癌样本量不足（仅16例，占3.27%）、回顾性病例对照设计可能引入谱系偏倚。研究结论指出，myESCAP是一种检测血液中食管癌特异性ctDNA甲基化的PCR检测方法，研究证明了其准确性和稳健性，在区分食管癌患者与非恶性对照方面表现出良好的敏感性和特异性，为进一步优化检测和临床转化奠定了基础。该论文发表于《Journal of Advanced Research》。
