CMTM6通过调控IFNRs-STAT1-KLF4信号轴维持造血干细胞稳态

《Journal of Advanced Research》：CMTM6 regulates hematopoietic stem cell homeostasis through modulating IFNRs-STAT1-KLF4 signaling axis

　　

CMTM6（CKLF样MARVEL跨膜结构域蛋白6）是一种III型跨膜蛋白，先前已知其通过结合PD-L1并稳定其在细胞表面的表达来影响免疫应答和癌症进展。在本研究中，研究人员发现CMTM6也通过与干扰素受体（IFNRs）相互作用并通过IFNRs-STAT1-KLF4信号轴调控造血干细胞（HSCs）的维持。研究人员证明，Cmtm6缺失会影响骨髓中造血干细胞的数目，并且CMTM6调控干扰素受体在细胞表面的稳定性。因此，CMTM6通过IFNR-STAT1-KLF4信号轴维持HSC稳态。简而言之，CMTM6直接结合PD-L1，稳定其在细胞表面的表达，从而影响免疫应答和癌症进展。在此背景下，Qiu等人证明了CMTM6还通过与IFNRs相互作用并通过IFNRs-STAT1-KLF4信号轴调控HSCs的维持。

研究背景与科学问题

造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSCs）是维持个体一生血液与免疫系统功能的关键细胞群体，其稳态受到精细调控。干扰素（Interferons, IFNs）是调节HSC功能的关键因子，但其效应具有双重性：适度信号维持HSC静息与自我更新，而过度或不足的信号则导致HSC耗竭或功能障碍。然而，调控干扰素受体（IFNRs）在细胞表面稳定性的机制此前尚不明确。CMTM6（CKLF样MARVEL跨膜结构域蛋白6）作为PD-L1的稳定剂在肿瘤免疫逃逸中被广泛研究，但其在正常造血尤其是HSC维持中的作用未知。为此，研究人员开展了本研究，旨在揭示CMTM6在HSC稳态中的生理功能及其分子机制。该论文发表于《Journal of Advanced Research》。

主要关键技术方法

研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了条件性敲除小鼠模型（B6.Cmtm6^floxp/floxpVav-Cre），实现造血系统特异性Cmtm6基因敲除。采用多参数流式细胞术分析外周血、脾脏和骨髓中各免疫细胞亚群及HSC亚群的频率与绝对数；通过体内BrdU掺入实验和Ki67染色评估HSC细胞周期状态；利用竞争性骨髓移植实验检测HSC的功能重建能力；应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对FACS分选的LSK细胞进行转录组学分析，并结合Monocle2进行拟时序轨迹分析和UCell算法进行通路富集评分；通过免疫荧光共定位、免疫共沉淀（Co-IP）及溶酶体抑制实验验证CMTM6与IFNAR1/IFNGR1的物理互作及对其稳定性的调控；最后通过KLF4过表达的回补实验验证下游效应分子。

研究结果

2.1. Cmtm6缺失破坏造血系统稳态

通过流式细胞术分析发现，与野生型（WT）相比，Cmtm6^-/-小鼠骨髓总细胞数增加1.3倍。外周血中粒细胞和巨噬细胞的比例及绝对数显著降低，而T细胞比例升高。脾脏中巨噬细胞数量和比例显著增加，而T细胞比例下降。骨髓中巨噬细胞和粒细胞的比例和绝对数均显著上调，B细胞比例减少。全血细胞计数分析显示中性粒细胞、红细胞、血红蛋白和血小板显著减少。这些结果表明Cmtm6缺失导致了髓系和淋巴系谱系的紊乱。

2.2. Cmtm6缺失促进HSC增殖

Cmtm6^-/-小鼠骨髓中LSK细胞的绝对数显著增加，但长期造血干细胞（LT-HSCs）的频率下降而绝对数增加。髓系祖细胞分析显示共同髓系祖细胞（CMPs）比例降低，而粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs）比例和绝对数显著升高。细胞周期分析显示，Cmtm6^-/- HSC中处于G0期的细胞比例显著降低（42.6% vs 69.6%），而S期比例升高（11.9% vs 6.47%）。5-氟尿嘧啶（5-FU）注射后，Cmtm6^-/- HSC在第4天更易被清除，但在第8天表现出更强的恢复动力学。

2.3. Cmtm6缺失损害HSC功能并增加DNA损伤

竞争性骨髓移植实验表明，Cmtm6^-/-来源的细胞（CD45.2）在受体小鼠骨髓LSK细胞中仅占17.7%，远低于WT对照组，表明其长期重建能力严重受损。此外，Cmtm6^-/- HSC中γH2AX焦点增多，彗星实验尾矩增大，提示DNA损伤积累。同时，α-微管蛋白极性丧失，呈现弥散分布，表明细胞极性受损。

2.4. 单细胞转录组图谱揭示Cmtm6缺陷HSC的分子特征

对FACS纯化的LSK细胞进行scRNA-seq，获得8305个Cmtm6^-/-细胞和5632个WT细胞的高质量数据。聚类分析鉴定出7个细胞群体，包括LT-HSC、ST-HSC、MPP等。拟时序分析显示分化轨迹（LT-HSC→ST-HSC→MPP）在两种基因型间无显著改变。通过模式分析将转录变化分为六个功能模块，涵盖DNA修复、细胞分化、炎症反应、细胞衰老和DNA损伤应答等。

2.5. Cmtm6缺陷损害HSC中的IFN应答信号通路

UCell算法分析显示，Cmtm6^-/- HSC中下调最显著的为IFN-α和IFN-γ应答通路。单细胞数据验证了经典干扰素刺激基因（如Isg15、Ifitm3、Irf7等）的表达降低。细胞周期分析进一步证实Cmtm6^-/- HSC向增殖状态（S期和G2/M期）偏移。GSEA分析确认了IFN-α应答和IFN-γ应答通路的显著抑制。

2.6. CMTM6与IFNAR1和IFNGR1物理互作并稳定其表达

Cmtm6缺失不影响Ifnar1和Ifngr1的mRNA水平，但显著降低了IFNAR1和IFNGR1的蛋白水平。免疫荧光共定位和Co-IP实验证实CMTM6与IFNAR1及IFNGR1存在直接物理互作。溶酶体抑制剂氯喹处理可挽救Cmtm6^-/- HSC中这两种受体的降解，表明CMTM6通过阻止其溶酶体降解来稳定IFN受体。

2.7. KLF4是CMTM6介导的HSC调控的关键下游效应分子

蛋白互作网络分析筛选出Klf4等多个关键节点基因。免疫荧光验证了KLF4蛋白在Cmtm6^-/- HSC中显著降低。体外回补实验显示，过表达KLF4可部分恢复Cmtm6^-/-骨髓细胞的集落形成能力，并显著减少γH2AX焦点数量，表明KLF4是该信号轴的关键下游效应分子。

2.8. CMTM6通过IFNR-STAT1-KLF4信号轴调控HSC稳态

Cmtm6^-/- HSC中STAT1的mRNA和蛋白水平降低，磷酸化STAT1（p-STAT1）诱导显著减弱。STAT1活性评分与Klf4表达在单细胞水平呈正相关。使用STAT1抑制剂氟达拉滨处理可同时降低p-STAT1和KLF4蛋白水平，证实STAT1活性维持KLF4表达。此外，观察到SIAH2降低、DYRK2升高、c-MYC降低和P53升高等伴随分子变化。

讨论与结论

本研究发现CMTM6通过保护IFNAR1和IFNGR1免受溶酶体降解，维持其在HSC表面的密度，进而通过IFNR-STAT1-KLF4信号轴调控HSC的静息、极性维持和基因组完整性。KLF4作为连接IFN信号与HSC功能的枢纽，其下调解释了观察到的增殖失控、谱系偏向、极性丧失和DNA损伤表型。该工作揭示了CMTM6在正常造血中的新生理功能，区别于其在肿瘤中稳定PD-L1的经典角色。研究结论为：CMTM6通过IFNR-STAT1-KLF4信号轴维持HSC稳态，这一发现拓展了对CMTM6生物学功能的理解，并为干预HSC相关疾病提供了潜在靶点。