胎牛血清（FBS）在油佐剂疫苗（OAV）中对大西洋鲑（Salmo salar）交叉缝合椎体、扁平椎及生长的影响

《Journal of Fish Diseases》：Effect of Foetal Bovine Serum in Oil-Adjuvanted Vaccines on Spinal Deformities and Growth in Atlantic Salmon (Salmo salar)

　　

大量研究表明，油佐剂疫苗（oil-adjuvanted vaccines，OAV）可在大西洋鲑（Salmo salar）中诱发多种不同副作用，包括脊柱畸形（spinal deformities，SD）。其中，一种于2020年首次描述并命名为交叉缝合椎体（cross-stitch vertebrae）的病理改变，与灭活鲑鱼甲病毒（salmonid alphavirus，SAV）疫苗的使用相关。历史上，大多数鱼类病毒疫苗含有在细胞培养中增殖的灭活全病毒。疫苗的灭活病毒组分除病毒颗粒外，还会含有细胞培养残留物，如细胞碎片、胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）和其他营养物质。本研究在受控实验条件下，采用不同银化（smoltification）和温度方案饲养大西洋鲑，测试了五种含或不含FBS和SAV的多价OAV配方。与免疫接种不含FBS疫苗配方的鱼相比，接种含FBS配方的鱼表现出显著更高的大体病理、交叉缝合椎体和扁平椎（platyspondyly）患病率，无论是否包含SAV。无论采用何种饲养策略，免疫接种含FBS疫苗的鱼组生长率也显著低于相应未受影响的对照组。生长率降低与个体鱼中≥ 10个连续椎体受该病理影响时交叉缝合病理严重程度更高相关。这是首个证明OAV中FBS存在与大西洋鲑脊柱畸形相关的研究。

研究背景：脊柱畸形（spinal deformities，SD）可导致大西洋鲑（Salmo salar）品质降级、生长下降并损害福利。基于X射线诊断已描述多种SD，历史上常见类型包括颅尾向压缩、椎体融合/强直（ankylosis）和脱位等；亚年鲑银化小鲑（sub-yearling smolts，S0's）在高温和快速生长条件下风险较高。油佐剂疫苗（oil-adjuvanted vaccines，OAV）可造成腹腔粘连和生长下降等副作用，并与SD相关。2020年新描述的交叉缝合椎体（cross-stitch vertebrae）病理，其严重表现与福利下降、外观畸形和屠宰品质降级风险增加相关；病因和机制未知，但药物警戒报告及Thorarinsson et al.（2024）的现场研究提示其与含灭活鲑鱼甲病毒（salmonid alphavirus，SAV）的OAV相关。多数鱼类病毒疫苗用细胞培养增殖灭活全病毒，疫苗中除病毒颗粒外还可能含细胞碎片、胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）等培养残留物。FBS是复杂生物液体，总蛋白浓度通常为30–45 mg/mL，其中白蛋白最丰富，通常为18–27 mg/mL；FBS中哺乳动物来源抗原和免疫球蛋白注入鱼体后的效应此前未见报道。本研究即比较含或不含FBS及SAV的OAV对脊柱畸形（重点为交叉缝合椎体）和生长的影响，并考察不同S0's银化与海水温度模拟策略。

研究人员开展了什么研究、得出什么结论、有何意义：作者制备并测试5种多价OAV配方（V1–V5）：V1含SAV且含FBS；V2含SAV但不含FBS；V3不含SAV且不含FBS；V4不含SAV但含FBS；V5含SAV但不含FBS并同时给予不含FBS的二价胰腺病（pancreas disease，PD）–传染性鲑贫血病毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）疫苗。鱼在光周期调控（PHOTO）或膳食盐功能饲料（FEED）两种银化方案下饲养，并在海水阶段模拟8月（AUG）或10月（OCT）转海温度与光周期。结果显示，含FBS的V1和V4组大体病理、交叉缝合椎体和扁平椎（platyspondyly）患病率显著高于不含FBS的V2、V3和V5组，而无论是否含SAV；椎体融合在各疫苗组均低且无显著差异。T2–T3阶段，不含FBS组在多个饲养方案下标准生长率（standard growth rate，SGR）显著高于V1，V4与V1相似；交叉缝合椎体严重者屠宰体重更低。结论认为，OAV中FBS和/或白蛋白的存在，而非灭活SAV成分本身，与交叉缝合椎体和扁平椎患病率增加相关；交叉缝合椎体严重程度与生长下降和屠宰体重降低强相关。意义在于将FBS含量识别为评估OAV配方时应考虑的关键风险因素，提示应将其纳入大西洋鲑疫苗风险–获益评估和接种方案设计。

关键技术方法（≤250字）：鱼卵为Aquagen AS（Trondheim, Norway）混合家系胚胎，在IMR Matre站孵化。共1700尾健康、规格分级且无可见畸形的幼鱼（parr）随机分缸，接种前5周以被动集成应答器标签（PIT-tag）标记。设置PHOTO（光周期调控）与FEED（含膳食盐功能饲料）两种银化方案，并在海水阶段模拟AUG与OCT两种转海温度/光周期。五种多价OAV（V1–V5）按每缸每疫苗20尾、16缸×100尾设计腹腔注射；4疫苗接种后周（wpv）转海水，12 wpv合并至同一海笼，57 wpv屠宰。采用盲法X射线评估椎体1–58并依据20类分类及交叉缝合椎体定义判读；记录大体病理、腹腔粘连0–6评分、SGR和条件因子（condition factor，CF），统计使用多元线性回归、精确logistic回归、ANOVA、Kruskal–Wallis检验和Spearman秩相关分析。

研究结果：
3.1 渗透压调节与死亡率：通过24 h海水挑战检测，PHOTO和FEED两银化方案鱼的血浆氯（Cl^?）和钠（Na⁺）水平正常且变异低，表明渗透压调节能力满意；淡水接种后无死亡，陆基海水期各80尾疫苗组中死亡为0–2尾；转入海笼后有鸟攻击及未明确原因死亡，最终疫苗组生存率91%–94%；屠宰时性别分布无显著差异（χ²=3.04，df=4，p=0.55；Cramér's V=0.046）。
3.2 大体病理与脊柱畸形：因不同饲养策略下屠宰时患病率相似，按疫苗组合并数据；通过屠宰大体病理和盲法X射线评估，含FBS的V1和V4组椎周肌肉病理连接组织形成与变色患病率分别为35.5%和39.2%，显著高于不含FBS的V2、V3和V5组（6.5%–7.9%）；交叉缝合椎体在V1和V4组分别为39.2%和51.7%，显著高于不含FBS组（0%–1.0%）；logistic回归效应量显示V2、V3、V5相对V1的交叉缝合椎体 odds 低98%–99%以上，V4相对V1 odds 增高；扁平椎呈类似但幅度较缓的模式，V2、V3、V5显著低于V1和V4；椎体融合患病率低（2.7%–4.7%）且各组无显著差异；雌雄间各病理患病率无显著差异。
3.3 增重：通过两时段SGR比较，T1（海水暴露）至T2（转海笼）各银化与转海方案内疫苗组间无显著差异，OCT组SGR如预期低于AUG组；T2至T3（屠宰）出现显著差异，在AUG转海下，PHOTO和FEED两银化方案中不含FBS的V2、V3和V5组SGR显著高于含FBS的参考疫苗V1，V4与V1相似；效应量约为相对V1增加0.03%–0.06%/天；OCT转海下，PHOTO银化中不含FBS组亦显著较快，FEED银化中仅V5显著快于V1；屠宰体重分布反映上述SGR结果；雌雄屠宰体重无显著差异；屠宰时腹腔副作用评分在各疫苗组间谱型相似。
3.4 交叉缝合椎体与增重：通过在V1和V4组内比较正常椎柱鱼与交叉缝合椎体鱼，正常鱼T2–T3的SGR显著高于交叉缝合椎体鱼；交叉缝合椎体鱼屠宰时CF显著高于正常 counterparts；将全数据集按连续受累椎体数递增分组后，个体出现≥ 10个连续椎体受累时屠宰体重显著降低；Spearman秩相关显示屠宰体重与连续交叉缝合椎体数呈显著中度负相关（r_s=?0.3508；p<0.0001）；部分交叉缝合椎体鱼兼有扁平椎和/或椎体融合，但这两类病理与正常 counterparts 比较未显示显著生长影响。

讨论部分总结：各疫苗组腹腔粘连副作用评分相似，因此不太可能解释共同海笼10个月期间的生长率差异；T1–T2各组生长无显著差异，而T2–T3中发生问题性椎体病理的V1和V4组生长显著低于椎柱正常比例高的V2、V3和V5组。雌雄比例及体重无显著差异，疫苗相关生长差异不太可能由性别比例偏倚。V1和V4内交叉缝合椎体鱼SGR较低而CF较高，与Trangerud et al.（2020）报道的中重度交叉缝合椎体鱼明显较短一致，提示该病理可能损害脊柱纵向生长，改变体重–长度关系；生长下降也可能反映疼痛/不适或游泳能力与摄食竞争力受损。屠宰时脊柱健康评估显示，含FBS疫苗V1和V4对大体病理、交叉缝合椎体和扁平椎有显著负面影响，且不受银化策略和温度方案影响；含SAV但不含FBS的V2和V5未显示这些椎体病理增加，不含SAV且不含FBS的V3与V2、V5生长和屠宰体重相似，说明OAV中SAV成分在无FBS时本身不诱导更高椎体病理。扁平椎可能仍不能排除矿物质缺乏等因素；椎体融合低且相似，可能与银化和早期海水期矿化受损、慢性炎症或操作机械应激有关。V1的FBS来自SAV生产细胞培养基，V4则在乳化前直接加入水相，二者FBS组分相似但不完全相同，可能解释V4大体病理和交叉缝合椎体患病率高于V1。V1配方类似Aquavac PD7（MSD Animal Health；2021年退出挪威市场，但本研究为研发实验室规模），交叉缝合椎体严重度与生长惩罚的关联与Thorarinsson et al.（2024）现场观察一致；机制仍未知。作者提出推测性假设：FBS中牛血清白蛋白等可诱导抗体，若与鲑内源同源蛋白交叉反应，可能参与自身免疫或其他病理过程；初步分析（M. Forlenza和M. Goldman未发表数据）用含FBS上清包被的酶联免疫吸附试验（ELISA）在商业养殖的交叉缝合椎体大西洋鲑血清中检出抗体，而未受影响 counterparts 未检出，提示FBS可引发特异性体液免疫反应，但特异性抗原靶点尚无数据，需专门研究；若血清白蛋白在鲑骨修复和生长中起作用，干扰其功能可能影响椎体发育，但这在鱼中仍属推测且未证实。FBS常用于病毒疫苗生产以支持细胞生长和病毒产量；挪威现有OAV中仅基于灭活SAV的单价PD疫苗ALPHA JECT micro 1PD在产品特性摘要（SPC）中列有交叉缝合椎体副作用警告（“common”，即每100尾中1–10尾）；专利文件涉及SAV增殖中使用10% FBS；1%–10%的交叉缝合椎体患病率，尤其轻中度，可能在常规屠宰质量评估中漏检；尚需进一步研究FBS中何种成分诱导病理及其机制。

研究结论翻译：综上所述，本研究表明，油佐剂疫苗（OAV）中胎牛血清（FBS）和/或白蛋白的存在，而非先前认为的灭活鲑鱼甲病毒（SAV）成分，与受试大西洋鲑交叉缝合椎体和扁平椎患病率增加相关。研究结果还显示，交叉缝合椎体严重程度与生长率降低和屠宰体重降低强相关，证实了该病理的生物学和生产相关性。总之，这些结果确定FBS含量是评估OAV配方时应考虑的关键风险因素。鉴于其对鱼类福利和经济性能的潜在影响，应在大西洋鲑水产养殖的疫苗风险–获益评估和接种方案设计中仔细评估FBS含量。