《HLA》：COMBO-RATE: An Experimentally Validated Bioinformatic Tool to Identify Promiscuous HLA Restrictions
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确定T细胞表位的HLA限制性对于理解感染性疾病、自身免疫和疫苗设计中的免疫应答至关重要。现有生物信息学程序（包括IEDB RATE工具）能够根据HLA分型供者的免疫应答数据推断单一HLA限制性。然而，T细胞表位常由多个HLA等位基因呈递，此现象称为多态性限制（
确定T细胞表位的HLA限制性对于理解感染性疾病、自身免疫和疫苗设计中的免疫应答至关重要。现有生物信息学程序（包括IEDB RATE工具）能够根据HLA分型供者的免疫应答数据推断单一HLA限制性。然而，T细胞表位常由多个HLA等位基因呈递，此现象称为多态性限制（promiscuous restriction），限制了单一等位基因方法的实用性。为解决此局限，研究人员开发了COMBO-RATE，作为RATE的扩展，系统性评估HLA等位基因组合以鉴定多等位基因限制模式。对涵盖不同抗原系统和不同表位发现策略的三个独立数据集的分析揭示，多态性限制是免疫优势表位的近乎普遍特征。聚焦于百日咳鲍特菌（B. pertussis）全基因组筛选中鉴定的43个免疫优势CD4?T细胞表位，COMBO-RATE优于传统RATE，为43个表位中的35个鉴定出限制性，而RATE单独仅鉴定24个，并发现了64个额外等位基因限制，包括29个独特等位基因。使用单HLA转染细胞系和抗原呈递实验进行的实验验证确认了COMBO-RATE推断的限制性，证明单一表位可由不同HLA等位基因独立呈递。总体而言，COMBO-RATE提供了一个稳健且可扩展的框架，可从现有群体应答数据中定义完整的HLA限制谱，对于设计需要在遗传多样性群体中实现广泛HLA覆盖的疫苗具有重要意义。该流程以Python包和用户友好型网络应用两种形式提供。
**研究背景与问题**
T细胞通过特异性T细胞受体（TCR）识别肽段（表位）与MHC分子（人类中为HLA）的复合物。表位的HLA限制性指能够结合并呈递该表位以供T细胞识别的特定HLA等位基因变异体。HLA限制性知识对于多种免疫学应用至关重要，包括多聚体/四聚体染色试剂的生产、纵向研究中预期应答供者的选择以及不同表位组合所提供群体覆盖率的预测。这对于设计提供广泛群体覆盖并确保在不同民族群体和具有多样HLA类型的地理区域中有效的疫苗尤为重要。
已有研究表明，不同HLA分子的肽结合能力可存在大量重叠，可归为广泛的HLA超型。因此，特定表位可结合多个HLA等位基因变异体，此现象称为"简并结合"（degenerate binding）。对于CD4?T细胞应答，最小表位通常对应于嵌入较长肽段内的9聚体核心序列，因为HLA II类分子在开放式结合槽中结合可变长度的肽段。能够在多个HLA变异体背景下被识别的表位通常称为"多态性"（promiscuous）表位。CD4?T细胞免疫优势指在特定抗原或病原体内优先识别有限子集的表位，受多种因素影响，包括抗原丰度与加工、表位侧翼序列、HLA结合亲和力与稳定性以及前体T细胞频率。多态性表位也可能促进免疫优势，因为其由多个HLA分子呈递可增加能够对特定表位应答的个体比例。
表位的HLA限制性可通过使用表达特定HLA分子的细胞系面板在抗原呈递实验中实验确定，但这些实验费时费力，因此已使用替代的计算方法。这些方法依赖于预测肽段对响应个体所表达HLA分子的结合能力，并确定是否有特定HLA分子与肽段反应性相关。特别是IEDB中的RATE程序，基于一组HLA分型个体的已知应答模式确定可能的潜在限制性。然而，目前没有明确且自动化的流程用于确定多态性限制，可能低估了表位限制性的真实广度。因此，研究人员修改并扩展了RATE方法以精确识别潜在的多态性限制，并在选定示例中对此方法进行了实验验证。
**主要技术方法**
研究人员通过百日咳鲍特菌全基因组筛选鉴定了43个免疫优势HLA II类表位（定义为超过4名供者识别），并在额外20名供者队列中测试（每个表位平均测试34名HLA分型供者）。研究使用了三个独立数据集：百日咳鲍特菌预测表位数据集、麻疹病毒（Measles virus）无偏重叠肽数据集和人类C9orf72蛋白数据集。COMBO-RATE算法基于RATE框架，迭代组合HLA等位基因并重新运行Fisher精确检验，直至p值不再改善。实验验证使用单HLA II类转染的DAP.3成纤维细胞系（L466.1表达DRB1*15:01、L554.3表达DRB1*01:01、L416.3表达DRB5*01:01、Tr166.0表达DRB1*03:01）作为抗原呈递细胞（APC），通过IFN-γ FluoroSpot实验 quantifying抗原特异性T细胞应答。供者PBMCs经肽段刺激扩增2周后与 pulsed或unpulsed APC共培养。HLA分型通过下一代测序（NGS）完成。结合预测使用NetMHCIIpan 4.1 EL方法。
**研究结果**
**多态性限制在优势表位中普遍存在**：在43个百日咳鲍特菌表位中，仅3个表位（7%）可由所有响应者中存在的单一HLA变异体解释（肽12的DRB4*01:01在6/6响应者中、肽33的DPA1*01:03~DPB1*04:01在6/6响应者中、肽41的DPA1*01:03~DPB1*02:01在3/3响应者中）。其余所有情况下，没有单一HLA能解释全部应答。响应者中最常见HLA II类分子的中位频率为0.60（范围0.46-1），最常见HLA的频率与响应供者数量呈负相关（R = -0.41，p = 0.007），进一步表明频繁被识别的供者不限于单一HLA。
**多态性HLA限制模式独立于肽段选择策略**：对使用无偏肽段选择的研究（麻疹病毒蛋白组和C9orf72）进行类似分析，麻疹数据集最常见HLA中位频率为0.71（范围0.50-1.00），C9orf72为0.67（范围0.50-1.00），不同数据集间无显著差异，仅2-4个表位可能由单一HLA分子限制。这表明多数表位在三个不同数据集中均与多态性限制相关，且独立于表位鉴定策略。
**评估潜在多HLA限制的策略**：COMBO-RATE算法首先组合p值最低的两个HLA（显著或趋势），记录新p值。若p值降低，则评估进一步组合第三低p值HLA的效果，以此类推，直至添加更多HLA不再降低p值。以表位P23为例，DRB1*15:01单独p = 0.048，仅存在于5/10响应者中；DRB1*01:01呈趋势（p = 0.113）；组合DRB1*15:01和DRB1*01:01得到更低的显著p值0.0015；进一步组合DRB1*08:02和DRB1*14:02得到最显著关联（p = 0.0002），该等位基因组合与10名响应者中9名限制匹配供者相关。
**COMBO-RATE鉴定潜在多HLA限制**：对全部百日咳鲍特菌表位，传统RATE可为43个表位中24个推断显著限制，平均仅解释35%（139/401）的供者/肽段实例。COMBO-RATE在17/43个肽段中分配了额外限制匹配供者（p < 0.0001），在8个传统RATE未推断出限制的案例中进一步推断了限制。总体而言，COMBO-RATE分组为220/401（55%）供者/肽段实例推断了限制，显著高于传统RATE的139/401（35%）（p < 0.0001），并显著改善了推断限制的p值。排除无限制可用的肽段后，该数字为220/330（67%）。此外，COMBO-RATE在该表位数据集中总体获得64个新等位基因限制，其中29个为独特等位基因。最终可为43个表位中35个推断HLA限制。
**COMBO-RATE推断HLA限制的实验验证**：选择FHA抗原来源的P23表位作为代表性示例进行验证。表达RATE推断的DRB1*15:01但不表达DRB1*01:01的供者（n = 3）与P23脉冲的L466.1（DRB1*15:01）APC共培养后，IFN-γ产生T细胞水平显著高于与P23脉冲的L554.3（DRB1*01:01）APC及亲本HLA-DR阴性细胞系共培养。表达COMBO-RATE推断的DRB1*01:01但不表达DRB1*15:01的供者（n = 2）与P23脉冲的L554.3 APC共培养后，IFN-γ产生T细胞水平显著高于与P23脉冲的L466.1 APC及亲本HLA-DR阴性细胞系共培养。进一步验证了PRN来源表位P13的COMBO-RATE推断DRB5*01:01限制性和FHA来源表位P33的DRB1*03:01限制性。这些实验将验证扩展至额外HLA等位基因，证明COMBO-RATE推断的限制性可在不同表位和抗原来源中实验重现。
**COMBO-RATE网络界面**：为使COMBO-RATE广泛可及，研究人员创建了网络界面（https://comborate.onrender.com），实现独立Python脚本（https://github.com/raphaeltrevizani/comborate_shared/tree/master）。COMBO-RATE扩展了RATE程序功能，迭代将不同HLA等位基因组合为超型并基于超型重新运行RATE分析，只要Fisher p值显著性改善。必填输入数据包括HLA分型供者和每个肽段的供者应答。默认情况下，网络实现自动配对供者文件中HLA-DP和-DQ等位基因的α链和β链，并使用应答 cutoff为1。可选地，COMBO-RATE允许基于IEDB网站结合预测方法结果过滤HLA-肽段关联，默认过滤前25%预测结果。输出文件包含每个肽段单独的RATE限制性及所有肽段汇总文件，summary_restrictions.csv汇总所有鉴定到的HLA限制性。
**讨论与结论**
对三个独立数据集（百日咳鲍特菌、麻疹病毒和C9orf72）的分析揭示，多态性限制不仅是常见的，而且是免疫优势CD4?T细胞表位中近乎普遍的特征。在测试的43个优势百日咳鲍特菌表位中，仅3个（7%）可归因于所有响应者中存在的单一HLA等位基因。值得注意的是，该模式并非计算表位预测策略的结果，在完全无偏重叠肽段文库筛选衍生的数据集中观察到相同的多等位基因限制模式。响应者中最常见HLA频率与总响应者数量之间的负相关进一步强调了这一点。免疫优势可能本身就是广泛HLA兼容性的结果。虽然多态性表位的存在早已被认识，但优势表位中单等位基因限制的近乎完全缺失——此处跨独立抗原和选择策略的系统性证明——是一项定量发现，促使重新考虑HLA限制性通常被表征的方式。
RATE算法提供了从HLA分型队列中表位应答模式推断HLA限制性的统计框架。然而，当多个HLA等位基因独立限制同一表位时（如数据所示是常态），单等位基因关联检验系统性功效不足。为解决此局限，研究人员开发了COMBO-RATE，一种迭代扩展RATE的方法，评估不同HLA等位基因的组合。COMBO-RATE应用于百日咳鲍特菌数据集显著优于传统RATE：限制匹配供者-肽段应答实例比例从35%增至55%（限于至少可推断一个限制的表位时为67%）；43个表位中35个鉴定出限制性（RATE单独为24个）；鉴定64个新等位基因水平限制包括29个单等位基因分析未检测到的独特等位基因；在11个RATE未返回任何显著关联的表位中恢复了限制性；在两种方法均鉴定出限制的表位中显著改善了p值。
本研究的关键优势是COMBO-RATE推断限制性的实验验证，此前研究从未全面进行过。使用跨多供者广泛识别的表位P23，确认DRB1*15:01和DRB1*01:01均可独立将同一肽段呈递给肽段特异性CD4?T细胞，从而验证了COMBO-RATE鉴定真实生物学限制性的能力。重要的是，该方法还鉴定了DRB1*01:01作为额外限制等位基因，其在单等位基因分析中未达到统计学显著性，否则将被忽视。基于NetMHCIIpan的核心预测表明，四个COMBO-RATE推断限制等位基因中的三个（DRB1*15:01、DRB1*01:01和DRB1*14:02）共享共同预测结合核心，而DRB1*08:02预测参与不同基序。对其他肽段的分析同样鉴定了同一15聚体内不同预测结合核心，支持多态性HLA限制可通过给定肽段内多个结合基序而非单一通用结合基序产生的观点。
优势表位中多态性HLA限制的近乎普遍性对疫苗抗原选择具有直接意义。由于多态性表位频繁定位于保守抗原区域，它们同时提供广泛HLA覆盖和降低突变逃逸易感性。少量此类表位可替代较大的多表位构建体，当与B细胞靶标偶联时，可确保遗传多样性群体中的广泛T细胞激活，解决早期单等位基因依赖性疫苗策略的关键局限。COMBO-RATE提供了从现有群体应答数据推导更完整限制谱的手段，无需超出标准表位表征研究已收集的额外实验工作。更广泛地，通过优先考虑最可能的限制等位基因，COMBO-RATE可指导未来研究中的实验验证工作，缩小需要实验测试的等位基因范围，减少所需限制性实验和HLA转染细胞系数量，同时最大化鉴定真实限制性的可能性。
研究人员还承认若干局限：第一，COMBO-RATE的统计功效与RATE一样随队列规模和HLA多样性而变化，对于稀有等位基因或响应者较少的表位，组合测试可能无法达到显著性；第二，COMBO-RATE无法推断研究群体中不存在的等位基因的限制性，部分结果可能受HLA等位基因间连锁不平衡影响；第三，虽提供多个表位的实验验证，但多数COMBO-RATE推断限制性仍为计算预测，预测结合能力不保证生理背景下的有效结合或呈递；第四，实验验证依赖单HLA转染细胞系的肽段脉冲，此人工抗原呈递系统绕过自然抗原加工，不能捕捉生理条件下抗原加工、HLA表面表达水平、肽结合亲和力或共表达HLA分子间竞争的潜在差异；第五，COMBO-RATE默认不应用多重检验校正，p值主要用于排序候选HLA-肽段关联而非作为正式假设检验阈值，COMBO-RATE旨在作为优先级排序工具，其输出随后通过实验或独立数据集验证。
总之，虽然多态性HLA限制早已被认识为CD4?T细胞表位的特征，本研究证明它实际上是跨独立抗原和表位发现策略的免疫优势近乎普遍模式。重要的是，COMBO-RATE直接解决了现有限制性推断工具无法可靠检测多态性HLA限制的问题。通过将COMBO-RATE作为 freely accessible工具提供，研究人员进一步旨在支持更准确和完整的HLA限制性表征，为疫苗设计、群体覆盖和抗原呈递机制研究带来下游益处。
