《RSC Pharmaceutics》：Novel plasmid DNA-loaded nanobubbles coated with chitosan oligosaccharides for enhanced gene delivery via systemic administrationOpen Access
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摘要专业翻译
高效的系统基因递送仍是非病毒基因治疗的主要瓶颈，主要归因于递送效率不足以及缺乏临床可规模化生产的载体。尽管超声（ultrasound, US）响应的微/纳米泡（nanobubbles, NBs）已展现出应用前景，但其性能关键取决于优化的阳离子表面
摘要专业翻译
高效的系统基因递送仍是非病毒基因治疗的主要瓶颈，主要归因于递送效率不足以及缺乏临床可规模化生产的载体。尽管超声（ultrasound, US）响应的微/纳米泡（nanobubbles, NBs）已展现出应用前景，但其性能关键取决于优化的阳离子表面，该表面能够在不影响声学行为的前提下实现质粒DNA（plasmid DNA, pDNA）的稳定可控装载。在此，研究人员通过工程化壳寡糖（chitosan oligosaccharide, COS）包被的纳米泡（COS-NBs），构建了一种兼具高效pDNA装载与维持超声造影性能的合理设计平台。COS包被改变了纳米泡的表面电位，并在0.4 mg mL?1浓度下实现了最大pDNA装载量，同时保持了纳米泡的直径（约200 nm）、浓度及超声成像活性。经系统给药后，pDNA装载的COS-NBs联合超声暴露在小鼠心脏中实现了荧光素酶表达7.02倍的增加，且在未受照射的器官中未检测到脱靶表达。血清生化检测仅显示4小时时的短暂变化，证实了其优异的耐受性。上述结果表明，COS提供了阳离子电荷与分子量之间的有利平衡，能够实现pDNA的稳定且可释放装载，从而支持纳米泡作为稳健、靶向且临床可应用的诊疗一体化平台，用于系统超声介导的基因递送。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
基因治疗已被广泛应用于多种遗传性疾病和获得性疾病的治疗，涉及病毒载体的直接体内给药、基因工程改造的T细胞或造血干细胞的过继转移以及新兴的基因组编辑技术。基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体凭借其天然的高感染性，在基因转染效率方面具有显著优势，但其临床应用受到免疫原性反应和插入突变风险的制约。此外，多种病毒载体的包装容量有限，难以递送大基因；生产过程复杂；免疫应答常常限制重复给药。相比之下，以脂质纳米颗粒和阳离子聚合物为代表的非病毒载体在货物尺寸方面具有更大的灵活性，生产更简单、可规模化，且免疫原性更低。然而，非病毒方法的体内转染效率通常低于部分病毒平台，表达持续时间较短，某些阳离子聚合物在高剂量下具有细胞毒性。
超声介导的药物和基因递送被认为是一种通过将物理能量定向至特定部位来实现靶向递送的安全方法。纳米泡（NBs）是含有回声造影气体的聚乙二醇（PEG）修饰脂质体，其空化效应可增强细胞膜通透性。然而，在系统给药场景下，经血管内注射的基因和核酸会迅速被降解或从循环中清除，且可能无法与纳米泡共定位，从而丧失其在血管内作为转染驱动力的功能。将基因或核酸装载到纳米泡表面可改善系统递送的效果。既往研究采用阳离子脂质构建核酸装载纳米泡，但阳离子脂质会导致纳米泡内气体保留不稳定。因此，研究人员将目光转向阴离子纳米泡，其具有更好的回声保留稳定性，并尝试通过表面包被阳离子材料来实现核酸装载。
本研究旨在通过系统给药递送分子量大于miRNA的pDNA，并考察将pDNA装载到纳米泡表面是否能提高递送效率。然而，基因与阳离子分子之间的强相互作用会抑制基因表达。此前使用的甲基乙二醇壳聚糖（MGC）是一种高分子量多糖，作为包被材料可能与pDNA产生强相互作用并削弱基因表达。为解决这一问题，研究人员选用低分子量阳离子寡聚物——壳寡糖（COS）作为包被剂。COS由壳聚糖经酶解或化学水解获得，具有显著改善的水溶性和生物利用度，在药物递送和免疫调节等生物医学领域具有广阔应用前景。
二、研究内容与核心发现
研究人员设计并制备了COS包被的阴离子纳米泡（COS-NBs），通过静电相互作用实现pDNA的高效装载，同时维持纳米泡的超声造影性能。经系统给药后，pDNA装载的COS-NBs联合超声暴露在小鼠心脏中实现了荧光素酶表达7.02倍的显著增加，且在未受照射的器官中未检测到脱靶表达。血清生化检测显示仅4小时时出现短暂变化，24小时后恢复正常，证实了该系统良好的体内耐受性。该研究证明，COS提供了阳离子电荷与分子量之间的有利平衡，能够实现pDNA的稳定且可释放装载，为开发稳健、靶向且临床可应用的超声介导基因递送诊疗一体化平台提供了重要支撑。
三、关键技术方法
本研究采用了以下主要技术方法：利用反相蒸发法制备阴离子脂质体，经挤出和过滤后，在充满全氟丙烷气体的密闭西林瓶中通过超声浴处理形成纳米泡；采用动态光散射法（DLS）测量粒径和Zeta电位，使用激光衍射粒度分析仪测定纳米泡的粒径分布和浓度；通过流式细胞术（FACSCelesta）评估YOYO-1标记pDNA与纳米泡的结合能力；使用临床超声诊断仪（LOGIQ E10s）对小鼠心脏进行B模式和造影谐波成像，评估纳米泡的体内超声造影性能；采用活体生物发光成像系统（IVIS）和荧光素酶活性检测评估体内基因转染效率；通过临床病理实验室的自动化分析仪（JCA-BM6050）检测血清生化指标以评估毒性。动物实验使用5周龄雄性ICR小鼠，购自东京实验动物科学株式会社，实验方案经东京药科大学生命科学大学动物实验委员会批准（方案编号：P23-67、P24-55和P25-62）。
四、研究结果
COS-NBs的制备与表征。 通过测量Zeta电位证实COS成功包被于阴离子纳米泡表面，包被后表面电位升高。流式细胞术分析表明，COS-NBs可通过静电相互作用装载pDNA，在COS浓度为0.4 mg mL?1时表现出显著高的pDNA装载能力，且装载量呈浓度依赖性增加，每60 μg纳米泡可装载高达25 μg的pDNA。值得注意的是，pDNA装载后Zeta电位无明显变化，提示装载的pDNA分子可能位于纳米泡表面PEG链形成的水化层内部或附近。粒径分布和浓度测定显示，COS包被和pDNA装载均未对纳米泡的粒径和浓度产生显著影响，未发生聚集。短期稳定性评估显示，在4 °C条件下6小时内粒径和浓度维持在初始值的±10%以内。
体内超声成像。 通过尾静脉注射纳米泡并对小鼠心脏进行超声造影成像，评估了阳离子分子包被纳米泡作为超声造影剂的效果。结果显示，未包被纳米泡、MGC-NBs和COS-NBs均表现出强烈的造影增强效果，各组之间无显著差异，表明阳离子包被不会改变纳米泡的超声响应性和气体保留能力。
包被剂对体内基因递送的影响。 通过将pDNA装载的纳米泡肌内注射至胫骨前肌（TA）并立即施加超声，评估了不同包被剂对基因转染效率的影响。结果显示，与未处理对照组相比，NBs和COS-NBs均显著提高了荧光素酶活性，而MGC-NBs与对照组无显著差异。直接比较进一步表明，MGC-NBs的荧光素酶活性显著低于未包被NBs，而COS-NBs与未包被NBs无显著差异且活性高于MGC-NBs。这表明MGC/pDNA复合物或NB/MGC/pDNA复合物的存在抑制了基因转染，可能机制包括pDNA装载改变气泡行为降低空化活性，或US照射后释放的MGC或MGC/pDNA复合物直接干扰基因表达过程。相比之下，COS与pDNA的相互作用较弱，对基因递送的抑制作用较小。
pDNA装载的COS-NBs（p-COS-NBs）增强系统基因递送。 通过静脉注射p-COS-NBs并联合超声暴露，评估了系统给药条件下的基因递送效率。在TA肌肉中，仅p-COS-NBs联合US组与未处理对照组和未施加US组相比表现出统计学显著的基因转染增加，而NBs、MGC-NBs及其联合US组均未达到统计学显著水平。在心脏靶向实验中，p-COS-NBs经静脉给药联合心脏US照射后，US暴露组织中基因表达显著高于未暴露器官。肺和膈肌中观察到轻微的基因表达增加，可能归因于US探针（直径15 mm）大于小鼠心脏（约10 mm）导致的宽照射面积。生化检测显示，COS-NBs联合US给药后4小时各项指标略有升高，但24小时后恢复正常，表明该组合引起的毒性和损伤是暂时的，影响甚微。
五、讨论与结论
本研究证明，利用COS阳离子包被可通过简单方法将pDNA装载到纳米泡上，制备COS-NBs。系统给药p-COS-NBs可更高效地将pDNA递送至靶组织。研究强调，包被材料可通过静电或物理化学相互作用调节超声介导的基因递送，因此根据装载分子的分子量和电荷选择最合适的包被材料至关重要。该系统的多功能性体现在可通过改变超声照射部位和所装载的pDNA，应用于多种疾病和治疗靶点。未来研究将包括在疾病小鼠模型中进行实验以更好地理解该递送系统的治疗潜力，如基因编辑癌症治疗。此外，本研究所用的理疗超声发生器此前已与微泡联合用于小鼠脑部和犬类肿瘤的药物递送，显示出其临床转化前景。对于临床转化，阳离子包被和基因或核酸装载（如p-COS-NBs）需要通过微流控等高效可重复的制造方法进行生产。总之，该方法作为超声造影和基因递送的诊疗一体化工具具有广阔的应用前景。
