集成脂质密封飞升室的有机电化学晶体管阵列用于膜蛋白活性的同步电学与光学检测

《Small》：Organic Electrochemical Transistor Arrays With Integrated Lipid-Sealed Femtolitre Chambers For Simultaneous Electrical and Optical Detection of Membrane Protein Activity

　　

研究人员报道了一种在玻璃盖玻片上制备52个离子敏感聚（3,4-乙撑二氧噻吩）:聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）有机电化学晶体管（Organic Electrochemical Transistors, OECTs）阵列的可扩展方法，每个晶体管集成一个含氟聚合物（fluoropolymer）微孔，由脂质双层（lipid bilayer）密封，用于膜蛋白的同步电学与荧光显微镜（fluorescence microscopy）研究。该架构通过提供由各自独立脂质双层段密封的独立流体储库（fluid reservoir），解决了现有OECTs阵列的一个关键限制，从而将膜蛋白扩散限制在定义的传感区域内。微孔内部填充含染料标记的50 mM KCl溶液并由脂质双层密封，外部覆盖无染料的100 mM KCl溶液。加入α-溶血素（α-hemolysin）后，七聚体孔（heptameric pores）的形成使K⁺离子得以扩散进入微孔，染料分子得以扩散出去，导致晶体管电导（conductance）与荧光强度（fluorescence intensity）同时降低。该集成平台在独立可寻址传感位点上结合了电学读出与光学读出，为更大规模的晶体管阵列以及脂质双层中重组膜蛋白的研究提供了多功能、可扩展的基础。

半导体器件微型化推动了电子器件与生物实体（从完整细胞到亚细胞成分）界面连接的发展。早期研究集中于离子通道与膜蛋白的电学检测，此后该领域主要沿两个方向发展：一是开发具有相对简单膜模型的新型器件平台，以创造性方式实现电子与生物功能的融合；二是构建更接近真实细胞膜的复杂膜模型，服务于药物发现与组织工程。在这一进程中，生物电子学研究者逐渐转向有机电化学晶体管（Organic Electrochemical Transistors, OECTs，一种电解质门控的有机电子器件）。OECTs的导电沟道通常由聚（3,4-乙撑二氧噻吩）:聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS，一种导电聚合物复合材料）构成，其多孔且亲水的特性提供了理想的生物界面，电解质中的离子可通过体积门控（volumetric gating，离子直接渗入沟道体相调控电导的机制）直接扩散进入沟道并作用于导电聚合物，使器件具有极高的跨导（transconductance，栅压对沟道电流的控制能力）和超越能斯特极限（Nernst limit）的离子灵敏度。自Bernards等人首次将PEDOT:PSS OECTs用作支撑脂质双层（supported lipid bilayer, SLB，沉积于固体表面的脂双层膜）下的膜蛋白传感器以来，该配置在过去五至十年间已成为研究各类膜蛋白系统的常用方案。

然而，现有基于支撑脂质双层的电子器件阵列存在关键局限：对脂质双层横向覆盖范围的控制有限。由于表面性质与形成方法的差异，双层往往无法覆盖整个流体孔，且多个器件共处于同一双层之下时，响应并非真正独立，因为离子可通过双层下方的公共扩展流体层自由扩散。此外，膜蛋白在双层中横向扩散，导致测量过程中特定器件附近的膜蛋白集合发生显著变化。因此，扩大双层生物电子传感器阵列规模的核心挑战在于使各个器件在流体学上彼此独立，即每个器件需拥有独立的集成流体储库，并由其专属的隔离脂质双层段密封，从而将蛋白扩散限制在相对于器件的已知有限范围内。虽有研究将多个宏观玻璃流体井胶接于盖玻片上，但采用光刻法将流体井集成于器件本身是更具可扩展性的替代方案，可使流体井尺寸缩小数个数量级。

针对上述问题，研究人员在玻璃盖玻片上报道了一种包含52个PEDOT:PSS OECTs阵列的可扩展制备方法，每个晶体管底部集成圆柱形微孔，微孔图案化刻蚀于公共含氟聚合物（fluoropolymer，具有高疏水性的全氟化材料）层中，该层同时实现金属互连与电解质的电学隔离。在实验条件下，每个微孔由独立的圆形脂质双层段密封。这一设计使OECTs具备流体学独立性，且52个集成微孔的器件被嵌入超过320万个非器件微孔构成的六方密堆阵列中，中心距约8 μm。这种高密度的非器件微孔结构使研究人员能够利用泊松统计（Poisson statistics），在纳摩尔浓度溶液条件下实现每器件几个至单个膜蛋白水平的检测。研究人员采用熟知的膜孔α-溶血素（α-hemolysin）演示了膜蛋白活性的同步电学与荧光检测。通过水-有机-水交换技术，每个微孔被内部含50 mM KCl与20 μM Alexa-488染料的缓冲液密封，外部则为无染料的100 mM KCl。加入α-溶血素后，单体插入双层并自发形成七聚体跨膜孔，使K⁺离子进入微孔引起晶体管电导变化，同时使Alexa-488分子缓慢逸出导致荧光强度变化，二者共同验证了膜蛋白活性。该工作最终提供了访问统计显著数量的流体学独立离子敏感OECTs的路径，为传感、生物电子学、药物发现及神经形态计算等应用开辟了道路，相关成果发表于《Small》。

关键技术方法方面，研究人员采用标准光刻工艺在玻璃盖玻片上通过三步光刻依次定义铝/金源漏电极与互连、PEDOT:PSS沟道及含氟聚合物（CYTOP）微孔层。针对CYTOP强疏水性阻碍光刻胶附着的问题，研究人员利用氧等离子体（O₂ plasma）处理临时提高表面亲水性以进行标准光刻，随后再次氧等离子体处理恢复疏水性以确保脂质双层密封产率。借助微流控系统（Elveflow）与水-有机-水交换法沉积脂质形成独立双层密封微孔。电学表征通过Ag/AgCl参比电极记录OECTs的转移特性、跨导及离子灵敏度；荧光显微系统同步记录微孔荧光强度变化，实现膜蛋白活性的双模检测。

研究结果如下：

器件结构与制备（Device Structure and Fabrication）：研究人员在毫米级玻璃盖玻片上通过三步光刻制备了52个OECTs。第一层沉积图案化铝（15 nm）与金（70 nm）作为源漏电极；第二层旋涂含乙二醇、十二烷基苯磺酸（DBSA）和（3-缩水甘油氧基丙基）三甲氧基硅烷（GOPS）添加剂的PEDOT:PSS并刻蚀形成沟道；第三层旋涂CYTOP并光刻定义微孔阵列。关键创新在于利用氧等离子体处理调节CYTOP疏水性，解决了强疏光刻胶附着难题，使标准粘度光刻胶得以图形化。该工艺使52个OECTs微孔与超过320万个非器件微孔构成六方密堆阵列，器件产率超过90%。

电学表征（Electrical Characterization）：研究人员在未密封双层条件下测量了OECTs的输出与转移特性。尽管制备沟道电阻因反复栅压扫描下PEDOT:PSS性能退化而有所上升，但器件间未观察到可测量的串扰（crosstalk，相邻器件间的信号干扰）。峰值跨导达到与典型PEDOT:PSS OECTs相当的水平。研究人员将Ag/AgCl电极保持在接近零栅压工作，以避免沟道退化和跨双层施加电化学偏压导致双层破裂。

离子灵敏度测量（Ion Sensitivity Measurements）：研究人员测试了OECTs对KCl浓度阶跃变化的电导响应。在1 mM至1 M范围内，离子灵敏度数量级为.../dec，但在低浓度时灵敏度降低。针对实验中的100 mM与50 mM KCl梯度，器件产生显著电导变化，远大于噪声阈值。尽管单盖玻片上器件间制备沟道电阻存在差异，但离子响应一致性良好，功能正常的离子敏感OECTs产率超过...

[KCl]梯度对密封微孔双层的影响（Effect of [KCl] Gradient on the Bilayer Sealing the Microwell）：研究人员采用水-有机-水交换法以脂质双层密封微孔，内部为50 mM KCl，外部为100 mM KCl。由于膜两侧渗透压差导致双层弯曲，若浓度差过大（如100 mM/1 mM），双层会显著向外弯曲或向内塌陷，增加自发破裂风险或限制染料扩散。经系统研究，100 mM/50 mM的浓度差被确定为最佳条件，它在保持适度约束曲率的同时提供可检测的电导响应，并将离子强度维持在生物相关范围。此外，基于α-溶血素孔形成产率研究，研究人员选择了负曲率（negative curvature，双层膜向微孔内部凹陷的几何形态）双层。

同步电学与荧光记录（Simultaneous Electrical and Fluorescence Recordings）：研究人员向内溶液加入α-溶血素（150 nM）并同步记录OECT电导与微孔荧光强度。α-溶血素单体插入双层形成七聚体孔，允许K⁺离子和Alexa-488染料通过。由于尺寸差异，K⁺离子扩散更快，OECT电导在约150秒内急剧下降，随后呈现较慢的尾部行为，这归因于K⁺离子从微孔横向扩散通过极薄的PEDOT:PSS沟道侧段，且沟道内离子迁移率与本体溶液不同。荧光强度呈近似指数衰减，与扩散计算一致。该同步检测确保电学信号源自膜蛋白活性而非双层破裂。研究人员发现实验前PEDOT:PSS水合状态显著影响电导尾部行为，且过长水合会导致CYTOP层剥离。实际实验条件下，每盖玻片可稳定获得数据的OECTs通常少于...个，主要源于器件微孔密封失败或双层破裂。

讨论与结论部分，研究人员总结了一种在玻璃盖玻片上制备52个离子敏感PEDOT:PSS OECTs的方法，每个OECT配备由独立脂质双层密封的流体学独立微孔。该架构通过为每个晶体管提供独立流体储库并限制膜蛋白扩散至定义传感区域，解决了现有阵列共享公共流体层及蛋白扩散导致的信号非独立问题。该集成平台结合电学与光学读出，为更大规模晶体管阵列及脂质双层中重组膜蛋白研究提供了可扩展基础。讨论强调，标准光刻与等离子体处理含氟聚合物的工艺兼具可扩展性，通过增加每盖玻片OECTs数量可促进基于统计分析实现每微孔膜蛋白计数，并推动集成高密度膜蛋白增强晶体管阵列在化学传感与神经形态计算中的应用，为先进微纳加工PEDOT:PSS OECTs阵列提供了前景。