面向按需滴落（DoD）生物打印的多重交联甲基丙烯酰化海藻酸二醛–明胶甲基丙烯酰基（ADAMa–GelMa）生物墨水

《Macromolecular Bioscience》：A Multi-Crosslinkable Methacrylated Alginate-GelMa Bioink for Drop-on-Demand Bioprinting

　　

为推动生物制造发展，该工作报道了一种基于甲基丙烯酰化海藻酸二醛（methacrylated alginate dialdehyde, ADAMa）与明胶甲基丙烯酰基（gelatine methacryloyl, GelMa）组合的多重可交联生物墨水。ADAMa在特定条件下使用甲基丙烯酸酐（methacrylic anhydride, MAAh）合成，并通过核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）、衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（Attenuated Total Reflectance—Fourier Transform Infrared Spectroscopy, ATR-FTIR）和凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC）分析确认了成功功能化及链长变化。所得ADAMa–GelMa生物墨水可通过多种独立机制交联，包括紫外（UV）引发光聚合、酶交联、席夫碱（Schiff-base）形成以及与钙离子（Ca²⁺）的离子凝胶化。该研究确认，随着GelMa含量增加，压缩模量从0.3增至30 kPa；ADAMa–GelMa生物墨水具有体外生物相容性，且在ADAMa:GelMa比例为25:75时细胞–材料相互作用增强。此外，通过纤维融合试验和网格结构试验分析，以及包括柱高和间距等指标在内的自立柱阵列结构保真度评估，评价了按需滴落（Drop-on-Demand, DoD）生物打印性能。多光子显微镜进一步显示打印柱内细胞分布均匀。总体而言，该系统提供可调机械性能、高细胞活力和强结构保真度，使其成为先进生物制造应用中制备复杂载细胞构建体的有前景候选者。

研究背景与问题：先进生物制造指利用前沿方法构建复杂生物系统，例如用于个性化与再生医学。按需滴落（Drop-on-Demand, DoD）生物打印逐滴沉积载细胞墨水，相比挤出或连续喷墨打印可更精确、以较快速度和较高分辨率逐滴放置；但存在打印时高剪切应力、z轴复杂结构打印困难以及需要低黏度生物墨水等问题。生物墨水是生物制造的核心，需具备生物相容性、仿生性、可降解性和生理环境稳定性，却常被视为瓶颈。海藻酸（Alg）和明胶（Gel）分别来源于藻类和动物，具有生物相容性且可通过不同机制交联；Alg可与多价阳离子离子交联，Gel可经三螺旋形成热凝胶，氧化海藻酸主要形成海藻酸二醛（ADA），可与含氨基组分经席夫碱（Schiff base）形成共价键，Gel还可经酶催化形成异肽键，甲基丙烯酰化则引入光聚合机制。GelMa常用MAAh合成，而ADAMa更常用2-氨基乙基甲基丙烯酸酯（AEMa）或EDC/NHS化学合成；MAAh基ADAMa与GelMa组合尚未讨论，高降解率和低机械强度可能是酯化路线较少采用的原因。该研究旨在构建极低黏度ADAMa–GelMa生物墨水，整合光聚合、席夫碱和离子交联机制以适配DoD，并从化学、物理机械、生物学和生物打印四类性质评估其适用性。研究人员开展ADAMa合成、GelMa混合、多交联、体外相容性和DoD打印评价，得出压缩模量0.3–30 kPa、ADAMa25细胞–材料相互作用增强、可打印自立柱和载细胞柱且细胞分布均匀等结果；该系统具有可调机械性能、高细胞活力和强结构保真度，是复杂载细胞构建体制造的候选平台，意义在于以多交联兼顾低黏度打印与打印后结构稳定，并突出ADAMa25配方的综合优势。

关键技术与方法（不超过250字）：研究人员采用甲基丙烯酸酐对氧化海藻酸进行甲基丙烯酰化制备ADAMa，并以NMR、ATR-FTIR、GPC及滴定法表征功能化、链长和氧化度；将ADAMa与GelMa按不同比例配制含LAP（lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate，光引发剂）的低黏度前体，经405 nm紫外光聚合、CaCl₂离子交联及mTG（microbial transglutaminase，微生物转谷氨酰胺酶）酶交联实现多交联；用流变、压缩测试、SEM和多光子显微镜评价物理机械与结构；以hTERT BJ1 td-tomato-farnesly报告细胞（由Friedrich-Alexander-Universit?t生化与分子医学研究所提供）进行2D WST-8细胞相容性测试；在DoD生物打印机上开展FFT（filament fusion test，纤维融合试验）、GST（grid structure test，网格结构试验）、自立柱阵列及载细胞柱打印。

研究结果：3.1 化学表征：研究人员通过¹H NMR（室温与70°C）、GPC、ATR-FTIR和滴定法分析ADA与ADAMa。ADA氧化度为13%（引自既往研究）；NMR在6.1–6.8 ppm（乙烯基区）和2.2–2.4 ppm（甲基区）出现新共振，确认甲基丙烯酸接枝，计算得甲基丙烯酰化度约20%（依信号为24.3%或17.9%）；GPC显示海藻酸Mw约2 MDa，ADA的Mw=423±55 kDa、Mn=168±60 kDa，ADAMa的Mw=249±13 kDa、Mn=68±11 kDa、分散度3.7，表明氧化和甲基丙烯酰化导致链长显著降低；ATR-FTIR在1720 cm^?1的酯键峰确认ADAMa合成，405 nm紫外120 s后出现2920和2850 cm^?1的-CH伸缩，提示交联。结论是约20%取代度提供足够光交联能力并保持灵活性和溶解性，化学修饰引起的分子量降低有利于DoD低黏度与打印后强度平衡。3.2 物理与机械表征：研究人员通过UV–vis观察到ADAMa比例≥50%时形成凝聚层并阻碍紫外透射，确定ADAMa25为DoD最佳混合比；流变显示光交联样品在聚合物浓度>0.6 w/v%时呈G′>G″凝胶行为，多交联样品在0.6 w/v%仍剪切变稀并呈凝胶行为，ADAMa25临界凝胶浓度为0.6 w/v%，限制因素为不可逆甲基丙烯酰共价键；4 w/v%水凝胶膜压缩模量为0.3–30 kPa，随GelMa含量增加而升高，ADAMa25多交联后最高；ADAMa100溶胀超过原体积2.5倍，GelMa样品未见溶胀；SEM显示ADAMa比例>50%时孔隙率增加、孔形不规则，可能与降解有关。结论是机械性能可在较宽范围调节，多交联增强稳定性，ADAMa25较适合DoD。3.3 体外生物相容性：研究人员通过2D接种BJ1 hTERT成纤维细胞并进行WST-8检测（1天和8天）评价。ADAMa25与GelMa表面细胞呈伸长形态，8天时ADAMa25相对活力约为ADAMa100的270%；GelMa含RGD序列可解释细胞相互作用增强；ADAMa100已完全降解而无法成像；LAP和自由基影响在所用低浓度和波长下可忽略。结论是未显示材料与细胞不良相互作用，ADAMa与GelMa在合适比例下组合有利。3.4 生物打印：3.4.1 打印过程评价：研究人员用FFT和GST在无细胞条件下评价4 w/v%墨水，GelMa含量越高打印质量越好，但不同混合比的strut直径和printability无显著差异，平均总直径0.6±0.1 mm；ADAMa较高时strut不均可能与低黏度和堵塞有关，printability值低于0.9，被认为undergelled；FFT显示可打印至1 mm线距；GelMa在120 s曝光下printability显著优于30 s（p=0.015），GelMa仍是打印性金标准，但DoD可将低黏度墨水打印成与挤出丝可比的结构。自立柱打印中GelMa最高2 mm，受打印头z轴移动限制；ADAMa25实现1 mm高、10层，受连续打印堵塞限制；ADAMa25在7层和2 mm线距下可保持柱不融合，GelMa 2 mm高柱需最小线距>1 mm。结论是ADAMa25可打印自立柱但稳定性预期低于GelMa，并提出DoD三维打印性初筛。3.4.2 载细胞打印：研究人员打印GelMa和ADAMa–GelMa毫米级载细胞水凝胶结构，并用多光子显微镜分析4 w/v% GelMa中1×10⁶ cells/mL细胞分布；垂直方向多数最近细胞–细胞距离低于约100 μm层高，未见层间或焊缝影响，水平分布更宽，水平与垂直中位距离分别为56±34 μm和45±31 μm，与参考值67±4 μm可比；ADAMa25的SEM和光镜显示细胞沿表面分布并保持均匀，支持立柱打印并显示打印后细胞均匀分布；载细胞GelMa中多数BJ1细胞呈圆形，24 h后可见细胞伸长，为4 w/v%高浓度GelMa的初步结果。结论是该系统可打印具有明确空间组织的载细胞三维结构，细胞分布均匀，但细胞形态受材料与打印因素影响。

讨论与结论：讨论部分表明，ADAMa–GelMa整合了海藻酸的结构优势与明胶的生物功能和机械贡献；多交联策略通过光聚合、动态共价作用和离子交联调节水凝胶性质，同时保留DoD所需的低黏度；ADAMa25在可重复打印性能、机械和生物学性质间较为有利，但ADAMa墨水仍需在堵塞、打印性和降解/溶胀等方面优化，GelMa在打印性上仍为金标准。研究结论翻译：研究人员开发了一种专为按需滴落生物打印设计的多重可交联ADAMa–GelMa生物墨水。甲基丙烯酰化氧化海藻酸与GelMa的组合形成了多功能水凝胶平台，整合了海藻酸的结构优势以及明胶的生物功能和机械贡献。对海藻酸的受控修饰在聚合物功能性与可靠液滴打印所需流变性能之间显示出合适平衡。所得ADAMa–GelMa系统通过光聚合、动态共价相互作用和离子交联机制的协同组合表现出可调机械性能。该多交联策略可在保持DoD加工必需的低黏度特征的同时调整水凝胶性质。所开发生物墨水表现出良好打印性、细胞相容性以及生成具有明确空间组织的三维含细胞水凝胶结构的能力。在所研究的配方中，ADAMa25结合了可重复打印性能与合适的机械和生物学性质，显示出特别有利的特征。总体而言，该研究确立了ADAMa–GelMa作为DoD生物打印灵活生物墨水平台的地位，并为先进生物制造中应用特异性水凝胶构建体的开发提供了基础。