《ELECTROPHORESIS》：Validation of a High-Throughput Fluorescent Capillary Electrophoresis Sodium Dodecyl Sulfate Method for Monoclonal Antibody Size Heterogeneity Assessment
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专业术语翻译摘要
荧光毛细管凝胶电泳（CGE）结合十二烷基硫酸钠（CE-SDS）为表征治疗性单克隆抗体（mAbs）提供了比紫外（UV）检测更强大、更高灵敏度的替代方案。美国药典（USP）等监管和标准组织仅收录基于UV的CE-SDS方法，阻碍了替代检测方法的采用
专业术语翻译摘要
荧光毛细管凝胶电泳（CGE）结合十二烷基硫酸钠（CE-SDS）为表征治疗性单克隆抗体（mAbs）提供了比紫外（UV）检测更强大、更高灵敏度的替代方案。美国药典（USP）等监管和标准组织仅收录基于UV的CE-SDS方法，阻碍了替代检测方法的采用。超越仅基于UV的CE-SDS方法的机会日益增多。在本研究中，研究人员展示了一种基于发光二极管（LED）荧光的平行CE-SDS方法在治疗性抗体的非还原和还原分析中的分析验证。以NISTmAb参考物质作为模型系统，评估了尺寸异质性关键质量属性（CQAs），包括单体纯度（非还原条件）、糖基化百分比（还原条件）和硫醚百分比（还原条件）。该荧光方法表现出高特异性和高精密度，单体纯度和糖基化的相对标准偏差（RSD）值<1%，硫醚的RSD值<3%，并且在进样电压、电泳电压、标记温度和标记缓冲液浓度的变化下均表现出稳健的性能。跨操作人员和试剂批次的耐用性测试确认了可重复性，准确性评估显示与美国国家标准与技术研究院（NIST）报告值及传统UV检测测量值高度一致。线性研究在非还原和还原分析中均获得决定系数（R2）>0.99。这些结果凸显了LED荧光平行CE-SDS作为mAb质量控制（QC）中经验证的、更高通量的传统UV方法替代方案所具有的高灵敏度、稳定基线性能及适用性。
论文解读文章
一、研究背景与目的
治疗性单克隆抗体（mAbs）因其靶向特异性抗原的能力，已成为自身免疫性疾病、哮喘和癌症等复杂疾病的重要治疗手段。截至2026年1月，美国已批准146种治疗性mAbs上市，自2015年以来年均新增约10种，表明生物治疗药物的采用率持续上升。大多数治疗性mAbs基于免疫球蛋白G（IgG）骨架构建，由两条重链（H，约50 kDa）和两条轻链（L，约25 kDa）通过链间二硫键连接而成，并可进一步通过糖基化等翻译后修饰增强整体生物物理稳定性。
在生物制品表达过程中，会产生源自细胞生产系统和纯化过程的杂质，包括抗体片段、宿主细胞蛋白和非糖基化mAb种类。因此，治疗性mAbs的开发和制造均需要严格的质量控制（QC）分析，以确保批间一致性。尺寸异质性关键质量属性（CQAs）包括单体纯度、糖基化百分比和不可还原/硫醚种类百分比。
传统上，CE-SDS在单毛细管系统上进行，使用时间校正峰面积进行尺寸异质性CQA分析，典型电泳时间约每样品20分钟，可无人值守运行多达96个样品。随着治疗性mAbs需求不断增长，需要更高通量的分析方法。平行毛细管电泳系统允许多个样品同时分析，大幅提高通量。然而，平行系统也因毛细管长度、直径和窗口位置的差异而增加了迁移时间和校正峰面积的变异性。
尽管荧光检测相比UV具有基线稳定性和灵敏度等潜在优势，但尚未被广泛采用于治疗性mAb QC，其较慢的采用速度可能反映了监管药典中缺乏相关收录，以及UV方法长期被接受的事实。因此，本研究旨在验证一种基于LED荧光的平行CE-SDS方法，为mAb QC提供经验证的、更高通量的替代方案。
二、主要关键技术方法
研究人员使用Agilent ProteoAnalyzer系统（12通道平行毛细管阵列，LED荧光激发结合电荷耦合器件（CCD）检测），采用Broad Range P240试剂盒，以NISTmAb（人源化IgG1K单克隆抗体，参考物质8671，批次14HB-D-002）作为代表性测试样品。非还原分析用于测定单体纯度、完整mAb尺寸和相对浓度；还原分析用于测定糖基化百分比、硫醚百分比以及轻链（L）、非糖基化重链（NGH）、重链（H）和硫醚的尺寸与相对浓度。数据使用Agilent ProSize软件分析，以6 kDa下标记物（LM）进行时间校正峰面积归一化。验证实验遵循ICH Q2(R2)指南，涵盖特异性、精密度（仪器和方法）、稳健性（进样、仪器、标记温度和标记缓冲液浓度）、耐用性、准确性和线性。作为对照，研究人员还在SCIEX BioPhase 8800系统上进行了UV吸收CE-SDS分析。
三、研究结果
3.1 特异性
研究人员通过比较含样品毛细管与空白基质毛细管来评估特异性。荧光方法中，空白分析在非还原和还原条件下均清晰显示未结合荧光染料产生的系统峰、用于样品对齐和相对定量的6 kDa LM以及紧随其后的少量杂质峰（推测来自LM，已排除在所有计算之外）。LM杂质之后的基线未出现符合积分参数的峰，表明不存在干扰信号。NISTmAb非还原和还原CE-SDS图谱与NIST先前发表的结果一致。相比之下，UV方法的基线表现出显著波动，尤其在非还原条件下。通过将长期漂移和短期噪声分别处理，荧光检测器的平均漂移-噪声比（% Drift/噪声）为0.03%±0.02%，而UV检测器为7.59%±3.79%，证明LED荧光检测器比UV检测器维持更稳定的基线。
3.2 精密度
仪器精密度通过从含NISTmAb和反应混合物的母液分装至6个孔测定。非还原条件下，单体纯度RSD为0.053%，相对浓度RSD为0.831%，尺寸RSD为1.311%。还原条件下，糖基化百分比RSD为0.011%，硫醚百分比RSD为2.534%。方法精密度通过6个孔中分别独立混合样品测定，单体纯度RSD为0.053%，糖基化百分比RSD为0.017%，硫醚百分比RSD为0.729%。相对浓度和尺寸的RSD值略高（3.793%和1.511%），这归因于单独混合样品而非从母液分装的固有特性。仪器和方法精密度测试中一致的CQA值证明了LED荧光CE-SDS用于mAb分析的高水平可重复性。
3.3 稳健性
研究人员评估了进样电压（6.9、7.0、7.1 kV）、电泳电压（8.9、9、9.1 kV）、标记温度（68°C、70°C、72°C）和10×标记缓冲液体积（44、45、46 μL）四个参数的变化。每个参数均以默认条件及上下偏差条件进行三次重复。所有测试均获得低RSD值：进样电压下单体纯度RSD为0.032%，糖基化百分比RSD为0.015%，硫醚百分比RSD为1.787%；电泳电压下分别为0.051%、0.15%和1.153%；标记温度下分别为0.140%、0.037%和3.867%；标记缓冲液体积下分别为0.032%、0.038%和2.839%。各参数均给出相似结果，证明LED荧光CE-SDS用于抗体分析的稳健性。
3.4 耐用性（中间精密度）
耐用性评估涵盖操作人员/天数和试剂批次两个维度。两名不同操作人员在不同天数使用相同试剂批次和仪器，各分析6个重复样品。操作人员1的单体纯度平均值为98.05%（RSD 0.056%），糖基化百分比为99.35%（RSD 0.012%），硫醚百分比为0.40%（RSD 3.226%）；操作人员2分别为98.08%（RSD 0.042%）、99.36%（RSD 0.011%）和0.39%（RSD 2.161%）。使用第二组试剂批次时，单体纯度平均值分别为98.07%（RSD 0.053%）和98.05%（RSD 0.056%），糖基化百分比分别为99.38%（RSD 0.011%）和99.35%（RSD 0.012%），硫醚百分比均为0.40%（RSD分别为2.534%和3.226%）。操作人员间和试剂批次间一致的CQA值证明了该方法的耐用性。
3.5 准确性
准确性通过将荧光方法测得结果与UV CE-SDS系统采集值及NISTmAb参考物质信息表发布值进行比较来验证。ProteoAnalyzer测得的单体纯度（98.07%）在NIST发布值（98.49%）的0.5%以内；糖基化百分比（99.38%）与NIST参考表完全一致；硫醚百分比（0.40%）在NIST报告值（0.30%）的0.1%以内。荧光与UV CE-SDS实验测得的糖基化百分比和硫醚百分比几乎相同，单体纯度百分差异约为1%。与UV CE-SDS实验值及NIST使用正交CE-SDS技术（单毛细管UV检测）发布值的一致性证明了荧光方法的准确性。
3.6 线性、检测限（LOD）和定量限（LOQ）
研究人员将NISTmAb稀释至约1000、1200、1500、1800和2000 ng/μL五个浓度，各浓度三个重复。非还原分析中，完整mAb的平均相对浓度对绝对浓度作图；还原分析中，将L、NGH、H和硫醚的相对浓度求和后取平均值作图。非还原和还原稀释系列均表现出高度线性，R2值均>0.99。在测试浓度范围内，平均单体纯度为98.14%（RSD 0.064%），糖基化百分比为99.4%（RSD 0.059%），硫醚百分比为0.40%（RSD 3.434%）。LOD测定为4.16±0.22 ng/μL，LOQ为5.02±0.24 ng/μL。
四、讨论与结论
讨论部分指出，治疗性抗体类别涵盖多种分子，包括mAbs、双特异性抗体、抗体药物偶联物和抗体片段。本研究以NISTmAb作为代表性样品，因其高度表征的特性允许与报告值及实验测定的UV CE-SDS值进行准确性比较。不同治疗性抗体在LED荧光和UV吸收CE-SDS值之间的接近程度可能因检测方法不同而有所差异。稳健性/中间精密度评估的程度取决于分析程序预期使用的条件，各实验室应确定是否需要评估额外变量。
研究结果表明，LED荧光检测可实现单体纯度、糖基化百分比和硫醚百分比CQAs的高度精确测量，所有测试的纯度和糖基化百分比CQA的RSD值<1%，硫醚百分比CQA的RSD值<3%。硫醚含量较高的RSD源于低浓度杂质的定量，与先前发表的CE数据一致。所有片段的尺寸精密度在所有测试中<5% RSD，多数<2% RSD；相对浓度结果类似，除两个值外均<5% RSD，多数<2% RSD。标记温度和标记缓冲液体积稳健性测试中NGH相对浓度RSD略高（5.728%和8.653%），可能归因于该杂质的低水平，但对CQA变异性影响极小。
荧光CE-SDS的稳定基线增强了对测定特异性的信心，而UV中特征性的基线漂移增加了低水平杂质误判或错误定量的可能性，通常需要扣除空白以增加峰判读信心，且因进样间基线漂移差异而具有挑战性。荧光方法无需空白扣除即可保持高精密度结果。
结论部分强调，随着治疗性抗体需求增长，需要更高通量和更稳定基线的方法。本研究所用荧光系统可在约30分钟内平行分析12个样品，可无人值守分析多达288个样品。尽管存在荧光高通量替代方案，但USP等组织发布的CE-SDS方法依赖UV吸收检测，限制了荧光方法的采用。本研究结果证明了LED荧光平行CGE方法的高特异性、稳健性、耐用性、准确性和线性，为个体治疗性mAbs的验证提供了起点。
