手性毛细管电泳分析灵敏度增强策略研究进展：样品预富集与UV–Vis替代检测系统的协同应用

《ELECTROPHORESIS》：Improving the Sensitivity in Chiral Analysis by Capillary Electrophoresis

　　

手性分析在众多科学领域（如制药、生物医学、农业化学、环境科学和食品科学）具有重要意义，这是由于立体异构体可能呈现不同的性质。毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）技术，主要包括电动色谱（Electrokinetic Chromatography，EKC）和胶束电动色谱（Micellar Electrokinetic Chromatography，MEKC），凭借其高选择性、方法多样性以及试剂和样品的低消耗，已成为实现对映体分离的成熟技术。在此背景下，方法灵敏度是一项关键特性，因为它决定了检测和定量对映体的能力，以及评估原料药、药物或农业化学制剂、食品配料等中对映体纯度的能力。本文综述了2022年至2026年6月期间报道的旨在增强手性CE技术灵敏度的分析策略，并将其应用于药物制剂以及生物、环境和食品样品的分析。离线与毛细管内预富集策略以及二者的联用，连同UV–Vis（紫外-可见）替代检测系统的使用，被描述为最有效的方法。本文展示了最具代表性的结果并对其进行批判性讨论。

1 引言

手性（Chirality）是众多科学领域的重要课题，因为立体异构体可能呈现不同的性质，且部分场景须满足法规监管要求。制药领域中，药物的一个对映体可能产生期望疗效，而另一个对映体可能呈现不同活性、无活性甚至毒性，这推动了手性纯药物的商业化，以避免非期望对映体对机体造成潜在损害。由于药物制剂中手性杂质的水平受法规监管，高灵敏度分析方法对于质量控制、新药活性成分的開発以及治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring）和临床毒理学不可或缺。食品领域中，禁止在部分食品生产中添加外消旋混合物，例如膳食补充剂中不允许添加D-氨基酸；生物与环境基质中药物或有毒物质的对映选择性测定同样构成分析化学领域的重要挑战。

尽管高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）仍是手性分析中最常用的分离技术，毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）已被确立为对映体分离的强有力选择。电动色谱（Electrokinetic Chromatography，EKC）在对映选择性分析中潜力巨大，具有分离高效、方法多样（可在分离缓冲液中添加多种商品化手性选择剂，而无需HPLC中昂贵的手性柱）、分析时间短、试剂与样品消耗低等优势，符合绿色分析化学（Green Analytical Chemistry）原则。环糊精（Cyclodextrins，CDs）及其衍生物作为手性选择剂，以及胶束电动色谱（Micellar Electrokinetic Chromatography，MEKC）中的胶束体系，在该领域具有尤为重要的意义。

然而，CE技术的主要缺点在于采用UV–Vis检测时浓度灵敏度有限，因为其光程即为毛细管的内径（Internal Diameter）而非常短。为克服这一局限，研究者提出了离线（Off-line）和毛细管内（In-capillary）预富集技术及其联用；此外，激光诱导荧光（Laser-Induced Fluorescence，LIF）、电容耦合非接触电导检测（Capacitively Coupled Contactless Conductivity Detection，C⁴D）和质谱（Mass Spectrometry，MS）等替代检测系统，也可与预富集策略联用开发高灵敏度手性CE方法，组合策略可达nM级检测限（Limit of Detection，LOD）。本文综述了2022年至2026年6月期间报道的策略，文献经Web of Science数据库检索确定（2026年7月初完成），检索词组合包括"capillary electrophoresis"、"electrokinetic chromatography"、"micellar electrokinetic chromatography"、"chiral"、"enantio*"、"preconcentration"、"stacking"、"sweeping"、"mass spectrometry"、"amperometric detection"、"capacitively coupled contactless conductivity detection"和"fluorescence"，仅纳入具有实际样品应用验证的方法学。全文分述：UV–Vis检测下的离线/在线预富集策略（或二者联用），以及替代检测系统（联用或不联用预富集技术）。

2 提升手性CE（UV–Vis检测）灵敏度的策略

本节讨论UV–Vis检测下增强手性CE灵敏度的最新策略，包括离线预富集、基于电泳原理的毛细管内预富集及二者的联用。

2.1 离线预富集技术

综述期内仅作为单一预富集方法使用的离线技术为基于吸附剂的萃取技术，包括固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）、磁性固相萃取（Magnetic Solid-Phase Extraction，MSPE）和微型固相萃取（Micro Solid-Phase Extraction，μSPEed）。SPE可提供高回收率且选择性好，但通常需专门的方法开发并使用有机溶剂；近期应用于河水中普萘洛尔及人尿中色氨酸与犬尿氨酸的测定。普萘洛尔经SPE预富集后，以纳米金刚石（Nanodiamonds）与人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）为手性选择剂进行EKC分析，对映体分辨率达2.9，方法适合处理较大体积水样以满足环境监测需求，S-和R-普萘洛尔的LOD分别为3.3和3.2 nM，回收率大于98%，为该类技术单独使用时所获最低LOD。色氨酸与犬尿氨酸以硫酸化-γ-环糊精（Sulfated-γ-Cyclodextrin，S-γ-CD）为选择剂实现同步对映体分离，分辨率分别为34和约8；样品经冻融脱盐-SPE（回收率接近100%）处理后，LOD在230 nm处为1.7和2.1 μM（D-和L-色氨酸）、在270 nm处为0.38和0.43 μM（D-和L-犬尿氨酸），与其在尿液中的内源水平（μg/mL级）相当。MSPE利用磁性颗粒在外加磁场下实现快速固液分离；研究者合成了双包覆（亲水单体与牛血清白蛋白）的限进型磁性分子印迹聚合物，用于人血浆中曲马多的选择性萃取，EKC以硫酸化-β-环糊精（Sulfated-β-Cyclodextrin，S-β-CD）为选择剂获得5.0的分辨率，优化条件（1 mL乙腈洗脱、20 mg吸附剂、60 s涡旋）使人血浆中每个对映体的LOD达0.19 μM。最新研究呈现采用新型微型化萃取技术的趋势：μSPEed基于限域于金属滤器间的微萃取柱与电子控制注射器，可精确调控流速与萃取体积并在升高压力下操作；以多孔聚合物吸附剂处理血清与废水中的杜韦利西布，回收率接近100%，预富集因子分别为2.5（血清）和15（废水），EKC在5.1 min内以磺丁基-β-环糊精（Sulfobutyl-β-Cyclodextrin，SB-β-CD）为选择剂实现分辨率3.0的对映体分离，LOD为0.14 μM（血清）和24 nM（废水）。离线技术主要聚焦于药物（环境水样与生物流体）及代谢物（人尿）的对映体分离，选择剂以CD为主，分辨率范围为2.9至34，各情形回收率均接近100%。

2.2 毛细管内预富集技术

此类策略利用背景电解质（Background Electrolyte，BGE）与样品基质之间电导率的差异，以及分析物在BGE与样品基质间电泳迁移率或溶解度的差异，使分析物在毛细管内聚焦富集，无需离线样品处理。场放大样品堆积（Field-Amplified Sample Stacking，FASS）将样品注入低电导基质，随后进入高电导BGE时分析物减速并在狭窄区带内堆积，简单而高效，但要求样品低电导率，常需脱盐等前处理。场放大样品进样（Field-Amplified Sample Injection，FASI）在进样期间施加高电压，利用电导率差异选择性地引入更多分析物而不增加进样体积。在帕洛诺司琼的MEKC比较中（胆酸钠为胶束体系），FASS因大体积进样缩短了有效分离长度、导致对映体峰重叠和分辨率损失，而FASI在灵敏度提升10倍（LOD 47 nM，回收率96%–100%，可定量0.03%和0.1%的对映体杂质）的同时不损害基线分离；在呼出气冷凝液（高度稀释基质）中氧氟沙星的EKC分析（万古霉素为选择剂）中，FASI预富集约2000倍远优于FASS（约5倍），LOD达1.4 nM，为采用在线技术作为单一预富集步骤所获最低LOD。FASI因简单、通用而成为近年来最常用的在线富集技术，并常与离线萃取技术联用。胶束到环糊精堆积（Micelle to Cyclodextrin Stacking，MCDS）用于抑制电渗流（Electroosmotic Flow，EOF）条件下小麦粉中中性丙唑菌酮对映体与阿特拉津的在线预富集：分析物在SDS胶束与中性α-环糊精界面因形成包合复合物而释放，较常规电进样提供59–79倍灵敏度增强，丙唑菌酮对映体在13 min内基线分离并与阿特拉津在约18 min内分离，LOD为0.28和0.35 μM。大体积样品堆积（Large-Volume Sample Stacking，LVSS）注入远大于常规体积的样品，在分离开始前驱除样品溶剂使分析物浓缩，特别适用于稀释基质，但优化不当时会增加峰展宽与选择性损失风险。扫集（Sweeping）利用BGE中存在的色谱假相（胶束或聚合物表面活性剂）在迁移中暂时保留分析物并将其浓缩为狭窄移动区带，适用于与假相相互作用强的低迁移率中性分析物。以S-β-CD为选择剂与扫集剂（因分析物与手性选择剂迁移率方向相反）测定大鼠血浆中西酞普兰，获得约8.0的分辨率；方法开发中因表面活性剂干扰分析物-CD相互作用而排除其使用；扫集进一步与LVSS（663倍）或阳离子选择性Exhaustive Injection（CSEI，低电导基质进样；2163倍，LOD 9.0 nM）联用，后者被选用于血浆分析。酮咯酸与酮普罗芬采用1-丁基-3-β-环糊精咪唑鎓托西酸盐（分辨率约1.5），扫集因干扰分析物-CD相互作用被排除；单一策略灵敏度提升有限，遂开发基于分析物电泳迁移率顺序调控的两步堆积程序（阴离子胶束输运化合物至狭窄区带，随后分析物在界面释放并与带正电选择剂形成包合复合物时有效迁移率反转），应用于药物制剂及血浆（蛋白沉淀后）中酮咯酸的测定，R-和S-酮咯酸LOD为0.17和0.22 μM，预富集因子分别为46和35。总体显示，FASI、MCDS、CSEI-扫集及FASS与LVSS联用的两步预富集最为有效；分辨率从基线分离到8.0（S-β-CD所达最高值）。

2.3 离线与毛细管内预富集策略的联用

两类策略的组合产生了综述期内UV–Vis检测所获最低LOD，共六篇文献报道了如下组合：LLE与FASI（美托洛尔血浆/尿液）、SPE与FASS（氨氯地平）、SPE与LVSS（GHRH类似物）、超声辅助分散液液微萃取（Ultrasound-Assisted Dispersive Liquid-Liquid Microextraction，UA-DLLME）与LVSS（巴比妥类）、以及超声增强型表面活性剂辅助分散液液微萃取（Ultrasound-Enhanced and Surfactant-Assisted Dispersive Liquid-Liquid Microextraction，UESA-DLLME）与聚二烯丙基二甲基氯化铵（Poly(diallyldimethylammonium chloride)，PDDAC）介导的堆积联用（米氮平），全部应用于生物样品。常规液液萃取（Liquid-Liquid Extraction，LLE）过程简单并可去除基质，近年进展集中于减少溶剂体积与采用环境友好型溶剂。血浆中美托洛尔以羧甲基-β-环糊精（Carboxymethyl-β-Cyclodextrin，CM-β-CD）为选择剂，LLE（乙酸乙酯，回收率78%）-FASI在约14 min内实现基线分离，LOD为11 nM；尿液中以红霉素为选择剂进行非水CE（Nonaqueous Capillary Electrophoresis，NACE）分离（分辨率2.9），LLE（回收率83%）-FASI使灵敏度增强173倍，LOD为0.015 μg/mL（0.056 μM），显著低于无预富集方法（2.8 μg/mL）；由于LLE仅提供4倍富集，灵敏度大幅提升主要归功于FASI；该研究揭示约三分之一患者S/R比值小于1，提示对映体监测可作为药物基因组学方法优化长期治疗结果的互补手段。氨氯地平需在人血浆中超痕量定量：SPE前处理实现稳健基质净化、降低背景噪声并间接提高灵敏度（回收率>85%），随后乙腈驱动FASS结合以(2-羟丙基)-β-环糊精（(2-Hydroxypropyl)-β-Cyclodextrin，HP-β-CD）为选择剂的EKC实现基线分离与0.6 nM级LOD（较10% BGE进样增强20–30倍）；与液相色谱-串联MS（LC-MS/MS）参考方法的药代动力学评价显示无统计学显著差异，验证了EKC用于常规监测的可靠性。GHRH类似物以2,6-二-O-甲基-β-环糊精（DM-β-CD）为选择剂、聚凝胺（Polybrene）涂层毛细管测定（因分析物带正电，堆积步骤与分离步骤极性相反），SPE-LVSS预富集因子达640，LOD由75–200 ng/mL改善至约10 ng/mL（3.0 nM）。UA-DLLME通过超声诱导声学空化促进萃取剂分散与传质，用于血清中两对巴比妥类对映体（40 μL氯仿、200 μL四氢呋喃分散剂，增强约140倍，LOD 0.42–0.44 nM）；随后注入大体积低电导样品并短时进样一段水柱，负压驱除样品溶剂与水柱后，带负电分析物在毛细管入口聚焦，UA-DLLME与LVSS联用总增强6300–6500倍，LOD降至约0.1 ng/mL（约0.4 nM），四个对映体峰在11 min内基线分离。UESA-DLLME在超声基础上加入中性表面活性剂（如Brij-35）促进分散与分析物增溶，用于米氮平（pH起关键作用，分析物为中性形式时萃取效率更高；120 μL四二氯乙烷、2 min超声，增强150–193倍）：PDDAC涂层毛细管在负电压下使电渗流朝向出口迁移，输运中性的DM-β-CD与进样分析物（67 nL），在碱性BGE中带正电的分析物逆向电渗流迁移并积累；LVSS（18–21倍）与UESA-DLLME联用实现2824–4022倍总增强，人尿与血清中LOD为0.08–0.54 ng/mL（0.3–2.0 nM），尿中米氮平LOD（0.3 nM）为UV–Vis检测手性EKC所报道最低值。各联用策略LOD为：美托洛尔11与56 nM、氨氯地平0.6 nM、GHRH类似物3.0 nM、巴比妥类0.4 nM、米氮平及其代谢物0.3–2.0 nM；值得注意的是，在巴比妥类与米氮平工作中，微型离线萃取才是灵敏度的主要贡献者，LVSS或PDDAC介导的堆积贡献相对较小。

3 UV–Vis之外的检测系统

扩展光程（如泡型毛细管）虽为简单途径，但常伴随峰展宽并损害分离度，故替代检测系统成为提升灵敏度最适宜的选择。综述的策略涉及LED诱导荧光（Light-Emitting Diode-Induced Fluorescence，LEDIF）、LIF、MS、安培检测（Amperometric Detection，AD）和C⁴D，部分方法还联用离线/在线预富集。

荧光检测虽先验地受限于具有固有荧光的手性分子数量，但衍生化可显著扩展其应用范围。研究者以(R)-(?)-4-(3-异硫氰酸吡咯烷基)-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑为衍生试剂处理鸡胶原水解物中3-和4-羟基脯氨酸及D/L-脯氨酸的四个对映体对，采用LEDIF检测，七(2,6-二-O-甲基)-β-环糊精（Heptakis(2,6-Di-O-Methyl)-β-Cyclodextrin，DM-β-CD）在10 min内同时实现分析物对映体分离，方法表现出优异的手性选择性和高灵敏度，LOD为0.08–0.20 μM，为肌病潜在生物标志物的立体异构体测定提供了有力手段。另一创新将中空纤维液相微萃取（Hollow-Fiber Liquid-Phase Microextraction，HF-LPME）与CE-LIF联用：以同手性沸石咪唑酯骨架-8（Zeolitic Imidazolate Framework-8，ZIF-8，D-His-ZIF-8）修饰中空纤维孔道，首次实现了对D/L-丝氨酸和D/L-天冬氨酸（荧光素异硫氰酸酯衍生化）的有效纯化与选择性富集（483–640倍，源于与手性通道的强几何依赖性氢键相互作用），CE-LIF以0.030–0.30 nM的LOD实现高灵敏度测定，并成功应用于健康志愿者的人唾液与呼出气冷凝液样品；采用绿色分析程序指数（Green Analytical Procedure Index，GAPI）和分析生态量表（Analytical Eco-Scale，AES）评估证实该方法为绿色替代方案。

基于CE-MS的方法开发颇具挑战，因手性选择剂通常是非挥发性化合物，需防止其转移至MS检测器：最常用的防止策略为部分填充技术（Partial Filling Technique，PFT，仅部分填充含选择剂的电解质）和对向迁移技术（Counter-Migration Technique，CMT，使用迁移率方向与检测器相反的选择剂）。以聚(丙烯酰胺-co-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠)共价涂层毛细管防止带负电的S-β-CD和S-γ-CD在内管壁吸附，PFT-EKC-MS在11 min内实现大鼠血浆中氯胺酮及其代谢产物的对映体分离（分辨率3.99–17.61）。环境水中苯丙胺类兴奋剂的测定表明，当低浓度选择剂足以实现所需分离时，EKC可在无需PFT或CMT的情况下与MS联用：0.1% γ-CD与0.1% HP-β-CD双CD体系不引起MS离子抑制，SPE回收率40%–67%，分辨率2.3–4.3，获nM级LOD。他达那非在废水中的测定联用FASS在线预富集，并通过CMT避免S-β-CD对MS的污染，对映体约28 min内基线分离，LOD 1.6 nM。首次将定量体积干燥尿斑（Quantitative Dried Urine Spot，qDUS）采样与EKC-MS联用用于尿中克伦特罗的对映选择性测定（CM-β-CD为选择剂，10 min内分离，分辨率约3）：qDUS在受控体积尿液沉积干燥中实现被动预富集并便于储存运输，随后经超声辅助萃取（Ultrasound-Assisted Extraction，UAE，50 kHz，5 min）与微波辅助萃取（Microwave-Assisted Extraction，MAE，1000 W，3 min）萃取至200 μL甲苯，蒸干后以50 μL BGE复溶，平均收率88%–96%；EKC中FASI再增敏50倍，并经CMT防止CM-β-CD到达离子源，LOD为0.36 nM；该工作反映了将采样、预富集与基质净化整合于单一工作流的趋势。

AD基于恒定电位下产生的电流测量，对电活性化合物提供低LOD与高选择性：以氯化胆碱-尿素低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DES）与CD组合的二元手性分离系统，用于药物制剂中肾上腺素和沙丁胺醇对映体的EKC-AD测定，两种组合（DES分别与HP-β-CD或CM-β-CD）均获得μM级LOD；UV光谱研究表明，DES的加入通过挤压效应增强CD对对映体的包合能力，促进更稳定包合复合物的形成，从而改善分辨率。C⁴D基于分析物区带与BGE间电导率差异，无需直接电接触、生色团或衍生化，对带电物种通用性强，但特异性较低，在复杂基质中分析物测定可能较为复杂。首次采用EKC-C⁴D实现了人尿中D-和L-2-羟基戊二酸的对映体分离（分离介质为4-(N-吗啉基)丁磺酸与聚凝胺，万古霉素为选择剂），优化条件下分辨率约2.0，D-和L-对映体LOD为3.8和3.6 μM，除用水简单稀释外无需样品前处理，并应用于两种不同代谢疾病（L-2-羟基戊二酸尿症与D-2-羟基戊二酸尿症）患者尿液样品中两种对映体的定量。五对吩噻嗪类药物在人尿与血清中的测定采用UESA-DLLME-FASI-EKC-C⁴D集成（HP-γ-CD为选择剂，18 min内全部对映体基线分离）：单独使用CE-C⁴D或仅用FASI时方法灵敏度不足、未观察到吩噻嗪峰，而该集成策略较单独EKC-C⁴D提高1200–2000倍检测灵敏度，LOD为0.16–0.31 nM。比较而言，分析灵敏度受待测分析物及整体分析方法（样品、制备步骤、预富集策略与检测系统）影响，各系统固有局限（荧光检测常需衍生化、非挥发性手性选择剂用于MS可引起电离抑制与源污染、C⁴D特异性较低）可能是选择最合适策略的关键因素；最重要的是，离线或在线预富集技术与手性CE联用构成提升灵敏度的有效途径。

4 结语

UV-Vis吸收检测因简单、成本低而仍是手性CE最常用的选择，但由毛细管内径定义的有限光程限制了弱吸收化合物或低浓度分析物（尤其复杂生物基质中）的灵敏度，因此必须开发在保持CE高对映鉴别能力的同时增强灵敏度的策略。离线与在线预富集技术的联用产生了UV–Vis检测所获最低LOD：UA-DLLME与LVSS联用约0.4 nM、UESA-DLLME与PDDAC介导堆积联用0.3–0.5 nM、SPE与FASS联用0.6 nM。可观察到从经典高溶剂消耗方法（SPE、LLE）向需样品和溶剂体积更低、易于与CE联用的微型化方法的明显转变；在线预富集技术集成度高、样品消耗少、避免了更耗时且操作复杂的步骤，是提升灵敏度的关键工具，其针对分析物性质、样品基质与手性分离系统的适当选择与优化对维持重现性与对映体分辨率至关重要。

替代检测系统极大拓展了CE在手性分析中的能力：CE与荧光检测（FD）和MS联用拓宽了其在低浓度水平或复杂基质中对映体测定的应用（归因于更低LOD与更高选择性）；AD与电导检测等电化学检测模式的集成亦为手性分离提供了有前景的扩展途径。LIF与HF-LPME联用（LOD 0.030–0.30 nM）及C⁴D与UESA-DLLME和FASI联用（0.16–0.31 nM）获得nM或亚nM级LOD；MS与SPE或FASS联用达nM级，与qDUS-UAE-MAE及FASSI联用达亚nM级（0.36 nM）并将采样、预富集与基质净化整合于单一工作流。所有MS检测工作均采用了避免非挥发性手性选择剂所致信号抑制与检测器污染的策略，通常以CMT为主，亦使用PFT；所有情况均采用电喷雾电离（Electrospray Ionization，ESI），包括纳米流量鞘液ESI-CE接口：无预富集时采用Orbitrap分析器获得亚μM级LOD（0.11–0.24 μM），采用QqQ分析器并结合预富集技术获得nM级LOD，多种策略联用产生MS检测最低LOD（0.36 nM）。从报道方法看，离线SPE及其变体（MSPE、μSPEed）以及在线技术（FASS、FASI、LVSS、扫集）表现出良好的可迁移性与稳健性，适用于常规应用；而涉及多种预富集策略与其他样品处理技术联用的复杂组合虽能有效增强灵敏度，却会显著增加分析复杂性。未来方向包括：(a) 应用于手性CE分析前的离线预富集策略微型化，以维持CE的本征绿色性；(b) 在线预富集技术的更高实施，以促进富集程序标准化；(c) 开发新型智能材料作为假相以促进手性CE对映选择性，包括与MS检测兼容的挥发性或半挥发性手性选择剂以避免电离抑制与源污染；(d) 设计稳健的CE-MS接口以提高系统可靠性与重现性；(e) 从传统试错优化转向设计实验（Design of Experiments，DoE）或质量源于设计（Quality by Design，QbD）策略以保证方法可靠性与稳健性；(f) 拓展手性CE至代谢组学、食品组学等需要高灵敏度分析复杂基质中手性标志物的相关生物学与食品领域。这些进展将巩固CE作为现代手性分析中多用途且有竞争力的技术的地位。