基于IR Biotyper的傅里叶变换红外（FT-IR）光谱用于猪链球菌血清型鉴别及机器学习分类评估

《Veterinary Research》：Application of Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy to discriminate serotypes of Streptococcus suis

　　

猪链球菌（Streptococcus suis）是重要的猪病原体，并被视为新发人兽共患病原体。血清分型在流行病学调查、致病性评估和疫苗策略中发挥关键作用。本研究评估了傅里叶变换红外（FT-IR）光谱（采用IR Biotyper系统）对属于13个不同血清型的94株猪链球菌分离株进行血清型鉴别的适用性。对1300–800 cm^?1光谱区域的分析显示出最高判别能力。主成分分析（PCA）/线性判别分析（LDA）显示，除血清型1/2和2外，受试血清型之间可清晰分离。分类器获得90%的总体准确率，当将血清型2和1/2视为单一类别时提高至96.7%。这些发现表明，FT-IR光谱是一种有前景、快速且成本有效的猪链球菌血清型鉴别工具。其性能、易用性及与机器学习方法的兼容性支持其在常规诊断和流行病学工作流程中的潜在应用。正如先前对其他临床相关细菌的报道，FT-IR光谱可作为分子分型的有价值补充方法，特别是在需要快速决策和高通量分析的情形中。

研究背景方面，猪链球菌（Streptococcus suis）是猪的重要病原体，也是新发人兽共患病原体，常定植于猪上呼吸道，可在断奶后阶段引起脑膜炎、败血症、多发性浆膜炎、关节炎和心内膜炎，并可经职业接触或摄入未充分煮熟的猪肉制品感染人，导致脑膜炎、心内膜炎、败血症、耳聋甚至死亡。该菌具有高度异质性：2005年以前分为35个血清型（SS1–34和1/2），后其中有6个血清型被重新分类至其他链球菌种，目前认为有29个血清型。血清分型对流行病学调查、致病性评估和疫苗策略均很重要；常用两步多重聚合酶链反应（PCR）靶向荚膜多糖（CPS）位点内基因，但耗时且流程较长。猪和人感染多由血清型2（SS2）引起，但猪侵袭性疾病优势血清型随时间和地区变化；欧洲一些国家SS9已成为猪侵袭性疾病主要原因，意大利猪病多由血清型9和1/2引起，血清型7亦常见；2015年泰国报告首例人SS9感染。因此，鉴定血清型不仅服务流行病学，也关系致病性、人兽共患潜力评估和疫苗选择；欧洲现有疫苗为菌体疫苗，不能保证不同血清型间交叉保护。FT-IR光谱是表型方法，基于不同官能团共价键在红外区的吸收特征，可反映脂类、蛋白质和碳水化合物等分子组合，形成微生物细胞“指纹”，已用于属、种、血清群/血清型及菌株水平识别和医院暴发与常规监测。研究人员因此评估商用IR Biotyper（IRBT）FT-IR系统用于猪链球菌血清型判别的适用性。研究显示，1300–800 cm^?1区域判别力最高，PCA/LDA可清晰分离多数血清型，但1/2与2重叠；分类器总体准确率为90%，合并2与1/2后为96.7%。这表明FT-IR有前景、快速且成本效益高，可作为分子分型的补充，支持常规诊断和流行病学工作流程，尤其适合快速决策和高通量分析；该研究亦为FT-IR用于猪链球菌血清分型的首次评估。

关键技术方法（≤250字）：样本为意大利11个大区22个省的猪源S. suis分离株，来源包括脑膜炎（63）、心包炎（1）、关节炎（4）、败血症（19）和肺炎（4）病例，另含参考株ATCC43765；摘要报告94株、13个血清型，材料与方法列出92株分离株加参考株，涉及23个ST。血清型经PCR确定，部分菌株行WGS（全基因组测序）和MLST（多位点序列分型）。采用IRBT FT-IR系统，按smear-UV方案制备样本，每样本4个技术重复；OPUS v8.2和IR Biotyper client v4.0采集4000–500 cm^?1光谱，经Savtizky–Golay二阶导数、矢量归一化和插值处理；以1300–800 cm^?1区域进行HCA（层次聚类分析）、PCA（主成分分析）和LDA（线性判别分析），并测试linear SVM（线性支持向量机）、RBF SVM（径向基函数支持向量机）和ANN（人工神经网络），采用四折交叉验证。

研究结果方面，Exploratory data analysis（探索性数据分析）：对全数据集1300–800 cm^?1区域分析显示最高判别力；PCA/LDA三维散点图显示血清型4、7、9、10和23清晰分离，偏差图显示血清型1、1/2、2、5、8、1–14、15和19分离。每组至少在1个维度可区分，但血清型1/2与2不可区分，血清型1与1–14亦存在不可区分情况。由此，该光谱区域支持多数血清型聚类，但特定近缘型存在光谱重叠。Machine learning（机器学习）：内部验证中RBF SVM表现最佳（C=10，gamma=0.0001）。将血清型2与1/2作为独立类别时，分类器准确率为90%（83/92）：5株血清型2被判为1/2，1株血清型2判为不确定，唯一血清型19被判为9；两株1–14中一株判为1、一株不确定。将血清型2与1/2合并为单一类别时准确率为96.7%（89/92），1株误分类、2株不确定。作者指出，准确率提高主要反映2与1/2相互误分类被合并解决，不应解释为FT-IR对二者单独区分能力提高。

讨论部分总结：FT-IR捕获细菌细胞全局生化指纹，反映碳水化合物、蛋白质、脂质和核酸变化；猪链球菌荚膜多糖是主要血清型决定结构，其生化组成在血清型间差异明显，预期影响红外吸收模式，尤其碳水化合物主导的1200–900 cm^?1区域，该区域与细菌细胞包膜多糖成分相关并可提供荚膜血清型判别信息；结果与既往针对表面多糖和细胞包膜结构的FT-IR分型研究一致。常规PCR血清分型易受交叉反应影响，常难分类不可分型或新变异株；WGS分辨率高但常规诊断成本高、耗时。FT-IR结合速度、重复性和判别力，适合高通量筛查。既往FT-IR已用于Salmonella enterica、Listeria monocytogenes、Escherichia coli和Streptococcus pneumoniae血清型区分，并与分子分型常具较高一致性；本研究为猪链球菌FT-IR血清分型的首次评估，且监督机器学习模型尤其支持向量机显示较高准确率。血清型2和1/2光谱重叠与其荚膜多糖结构高度相似有关：血清型2侧链含半乳糖（Gal），血清型1/2相应位置为N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）。局限包括培养条件、样本制备和菌株生物变异可能影响FT-IR表现，近缘血清型可有部分光谱重叠；需扩大参考库、增加特征明确菌株和现场样本验证，并可整合FT-IR与基因组数据。研究结论翻译：本研究证明，FT-IR光谱可能作为一种新型可靠、快速且成本效益高的猪链球菌血清型鉴别工具；其有前景的性能、易用性及与机器学习方法的兼容性支持其在常规诊断和流行病学工作流程中的潜在应用。正如对其他临床相关细菌的观察，FT-IR光谱可作为分子分型的有价值补充方法，尤其在需要快速决策和高通量分析的情形中。