生理温度下大通道单体载体上未稀释人血浆的直接色谱处理

《Journal of Chromatography B》：Direct chromatographic processing of undiluted human plasma on large-channel monolithic supports at physiological temperature

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  未稀释的人血浆直接在大通道整体柱上进行处理。
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  测定的凝血和补体参数未显示系统性变化。
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  在单一色谱步骤中因子VIII富集高达35.7倍。
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  避免了导致血浆色谱分析偏差的稀释和沉淀。

引言

人血浆是一种复杂的生物液体，含有300多种不同的蛋白质，其中许多是治疗血友病、原发性免疫缺陷和创伤相关凝血障碍等疾病的不可替代的治疗性蛋白[1]，[2]。工业血浆分离主要依赖于20世纪中期开发的两种工艺：1946年由Cohn及其同事引入的冷乙醇沉淀法[3]，以及1964年由Pool等人首次描述的冷沉淀法，该方法可产生富含因子VIII（FVIII）、血管性血友病因子、纤维蛋白原、因子XIII和纤维连接蛋白的冷不溶性沉淀物[4]。尽管这两种方法在工业规模上仍被广泛采用，每批次处理10,000至50,000份供体血浆池，但它们依赖于pH、温度、离子强度和乙醇浓度的顺序变化[2]，[3]，[5]，需要精心管理以最大限度地减少蛋白质变性、限制收率损失并避免凝血级联的激活[2]。在过去几十年中，色谱纯化步骤日益与沉淀基工艺相结合，使得能够从冷沉淀、冷沉淀去除血浆和各种Cohn组分中分离出丰度较低的蛋白质，如α1-蛋白酶抑制剂、血管性血友病因子和维生素K依赖性凝血因子及抑制剂[2]，[6]，[7]，[8]。特别是亲和色谱已在工业上应用于FVIII和因子IX的纯化，使用肝素、明胶和固定化抗体等亲和配体[6]。在一项相关进展中，硫酸酯型阳离子交换剂被证明比常规磺酸型树脂表现出显著更高的耐盐性和疏水性，这些特性使得凝血因子IX能够在无需预先处理样品的情况下，从凝血酶原复合物浓缩物中与其他维生素K依赖性凝血因子选择性分离[9]，[10]。更广泛地说，复杂的生物原料，包括发酵罐上清液、澄清的细胞匀浆和人血浆，在色谱捕获前通常需要昂贵的稀释或超滤/透析过滤[10]。尽管如此，将冷沉淀去除血浆或未稀释人血浆直接应用于常规颗粒基色谱柱在技术上仍具挑战性。人血浆的粘度随温度降低而升高[11]，[12]，而血浆的复杂大分子组成及其在与高表面积材料接触时易发生凝血级联激活的特性，可能导致孔道堵塞和过度的背压[9]，[13]。

在此背景下，FVIII是一个特别有价值且在色谱上要求苛刻的靶标，因为它仅以约0.1–0.2 μg/mL的浓度存在于血浆中，功能不稳定，并且与血管性血友病因子（vWF）以紧密的非共价复合物形式循环[14]，[15]，[16]。FVIII在临床和经济上都很重要，因为替代疗法需要反复静脉注射这种昂贵的蛋白质[17]。一项针对既往未治疗的重型血友病A患者的随机试验发现，使用血浆来源的含vWF的FVIII，其FVIII抑制物的发生率低于重组FVIII[18]，而FVIII-vWF浓缩物也用于治疗血管性血友病[19]。常规的血浆来源FVIII生产通常以冷沉淀开始，该步骤与约30%的FVIII活性损失相关[2]，而回收率强烈依赖于加工条件，特别是解冻和温度控制[20]。因此，从解冻、离心、未稀释的血浆中直接进行色谱捕获，可以绕过冷沉淀作为初始分离步骤，并可能减少与该过程相关的处理和回收损失。

整体色谱载体代表了与传统颗粒基固定相根本不同的架构。与溶质传输进入结合位点受扩散限制的多孔微球不同，整体柱是连续的多孔体，被互连的流通通道所渗透，其中质量传递主要是对流的[21]，[22]。这显著降低了与颗粒内扩散相关的动力学惩罚，并使得分离性能和动态结合容量对流速的敏感性远低于微球基柱[23]，[24]。对于血浆处理而言，大通道整体柱架构相比填充床具有两个额外优势。首先，微米级范围的通道直径比传统色谱微球的扩散孔孔径宽几个数量级[13]，[24]。因此，由大分子聚集体、冷球蛋白链或脂质颗粒引起的渐进性堵塞本质上比在填充床介质中更不可能发生。其次，死端孔的有效缺失最小化了在填充床柱中此类物质优先积累的停滞区的形成。整体载体每柱体积的总接触表面积低于微球基介质[24]，这也预计会减少与血浆接触时表面驱动的凝血和补体系统的激活[13]，[25]。

整体色谱起源于Tennikova、?vec及其合作者开发的致密多孔聚合物载体[22]，[26]，[27]，随后演变为商业化的对流相互作用介质（CIM?）形式，从分析圆盘到大型制备型径向流柱[21]，[22]，[24]，[28]，[29]。其历史发展和更广泛的应用已在别处详细综述[21]，[22]。

尽管整体柱具有有利的流动特性，但未稀释血浆的直接色谱处理在技术上仍具挑战性，特别是在较低温度下。主要障碍是粘度。在4 °C（传统上用于保护不稳定蛋白质和诱导冷球蛋白沉淀的温度）下，人血浆的粘度相对于37 °C下的生理值1.10–1.30 mPa·s显著升高[11]。样品稀释（通常2–5倍）一直是标准的解决办法，但这增加了处理体积、延长了处理时间并提高了成本[13]。在本研究中，通过在接近生理温度（约36 °C）下操作来解决这一难题[13]。在约36 °C下，血浆粘度接近其生理值，这为色谱处理提供了潜在优势。我们假设血浆在生理温度下的天然低粘度，结合整体载体的通道结构，能够实现未稀释血浆的对流流动而不会堵塞；同时，整体柱通道网络的低表面积和化学修饰预计能防止凝血和补体级联的激活。

在整体色谱用于血浆蛋白处理的更广泛背景下，FVIII在整体柱和致密多孔载体上的色谱分离已被先前证明。?trancar等人[30]使用QA官能化的GMA–EDMA致密多孔管从经Al(OH)₃吸附和溶剂/去污剂灭活预处理的冷沉淀中捕获FVIII-vWF复合物。Amatschek等人[31]和Necina等人[32]在CIM聚甲基丙烯酸酯整体柱上开发了肽亲和配体，并将其应用于纯化的FVIII制剂和稀释的血浆来源基质。然而，在所有这些研究中，色谱原料都是生产过程中的FVIII中间体或稀释或加标的基质，而不是未稀释血浆。因此，本工作使用解冻、离心、未稀释的新鲜冷冻血浆（FFP），在接近生理温度（约36 °C）下处理作为目标原料。

Wilate是一种血浆来源的FVIII-vWF浓缩物，采用阴离子交换色谱、双重病毒灭活和尺寸排阻色谱生产[33]，[34]。它已获得FDA孤儿药认定用于治疗血管性血友病[35]，并在美国获批用于12岁及以上血友病A患者的常规预防治疗[36]。其他vWF浓缩物和治疗方法也在临床开发中[19]。

在本研究中，我们评估了未稀释、离心的人血浆能否在接近生理温度（约36 °C）下使用大通道甲基丙烯酸酯整体柱直接处理。与本次评估相关的凝血和补体途径总结于图1。我们使用了两种具有不同表面化学性质的CIM整体柱来实现互补目标：（i）亲水性羟基（OH）整体柱，用于评估未稀释血浆的直接通过、非特异性蛋白质保留以及测定的凝血和补体相关参数的变化；（ii）季铵（QA）强阴离子交换整体柱，用于评估FVIII的选择性保留和富集。选择大通道（6 μm）架构是为了降低在直接加载粘稠、富含颗粒物血浆时堵塞的风险[13]。本研究的创新性在于概念验证证明，使用大通道（6 μm）整体载体在接近生理温度（约36 °C）下直接处理未稀释、离心的人血浆。（见表1。）

章节片段

血浆

新鲜冷冻人血浆（FFP）作为单一供体单位（260 mL，B+血型）从克罗地亚普拉总医院输血医学科获得。血浆在?30 °C下储存直至使用。

色谱柱

使用两根CIMmultus整体柱（Sartorius BIA Separations，Ajdov??ina，斯洛文尼亚）：（i）CIMmultus OH，1 mL柱床体积，6 μm平均通道直径，带有亲水性羟基；（ii）CIMmultus QA（强阴离子交换剂），8 mL柱床体积，6 μm平均通道

未稀释血浆在羟基整体柱上的处理

本实验的主要目的是证明未稀释人血浆可以流经大通道整体色谱载体而不发生堵塞，并评估与OH表面接触后非特异性蛋白质保留以及测定的凝血和补体相关参数的潜在变化。在加载50 mL未稀释血浆期间，柱压保持在0.10至0.20 MPa之间，没有表明渐进性污染或

结论

本研究提供了概念验证，证明未稀释人血浆可以在接近生理温度（约36 °C）下直接在大通道整体载体上处理。OH整体柱允许50个柱体积的未稀释血浆通过而无背压的渐进性增加，同时FVIII活性以及测定的凝血和补体相关参数在处理过程中未显示系统性变化。在QA整体柱上，FVIII从

CRediT作者贡献声明

Jasmina Simovi? Medica：撰写 – 初稿，验证，方法学，调查，正式分析，概念化。Marija Begi? Kokan：撰写 – 初稿，验证，调查，正式分析，概念化。Tomislav Friganovi?：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，可视化，验证，软件，方法学，数据管理。Petra Grb?i?：撰写 – 审阅与编辑，验证，调查，正式分析，概念化。Lucija Don?evi?：

利益冲突声明

作者声明，他们不存在已知的可能影响本文报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

Jasmina Simovi? Medica|Marija Begi? Kokan|Tomislav Friganovi?|Petra Grb?i?|Lucija Don?evi?|Marko Filipovi?|Dajana Ga?o-Soka?|Djuro Josi?