碘帕醇原料药中黄曲霉毒素与赭曲霉毒素A的ELISA和UPLC-MS/MS检测方法建立与验证

《Journal of Chromatography Open》：Methods for Aflatoxin and Ochratoxin detection applied to the analysis of an Active Pharmaceutical Ingredient

• 黄曲霉毒素（aflatoxins, AFs）和赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）等真菌毒素是毒性极强的霉菌代谢产物。
• 目前尚未在原料药（active pharmaceutical ingredients, API）中考察真菌毒素。
• 若检出霉菌污染，则真菌毒素检查变得至关重要。
• 酶联免疫吸附试验（ELISA）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是高度灵敏且极具特异性的技术。
• 研究人员已在碘帕醇（iopamidol）中验证ELISA和LC-MS/MS方法用于真菌毒素检测。

真菌毒素（mycotoxins，丝状真菌次级代谢产物）是影响人及动物健康的重要污染物，其中黄曲霉毒素（aflatoxins, AFs）和赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）毒性突出。AFs主要由曲霉属产生，AFB₁被国际癌症研究机构（IARC）列为1类人类致癌物，并与肝癌、免疫抑制和生长受损相关；OTA可损伤肾脏、抑制免疫并具有潜在致癌性，被IARC列为2B类可能致癌物。人暴露主要经膳食摄入，但药品领域中，真菌毒素检测目前仅在草药中有报道。对于非无菌原料药（active pharmaceutical ingredients, API），欧洲和美国药典要求进行微生物污染检查（包括酵母和霉菌，即生物负载试验），但仅检查细菌内毒素，不检查真菌毒素。即使实施污染控制，意外事件仍带来残余污染风险；若API发生真菌污染，最终药物制剂可能含真菌毒素。因此，一旦检出霉菌污染，API中真菌毒素检查尤为关键。碘帕醇（iopamidol）是计算机断层扫描（CT）碘基对比剂，以无菌制剂高剂量给药，最高达4.1 mL/kg、370 mg碘（I）/mL，因此要求极低的可接受限（acceptable level, AL），且高剂量基质易干扰检测。基于口服每日耐受摄入量（tolerable daily intake, TDI）AFs <1 ng/kg、OTA <1.4 ng/kg（70 kg成人分别<70 ng/day和<98 ng/day），考虑肠道吸收高并将口服至注射转换因子设为5（较ICH Q3D更保守），得注射TDI AFs <14 ng/day、OTA <19.6 ng/day；按碘帕醇最大注射剂量216.7 g计算，AL为AFs 65 pg/g、OTA 90 pg/g。研究人员因此开发并验证AFs和OTA在碘帕醇API中的检测方法，以解决高灵敏、高特异检测及基质干扰问题。

关键技术与方法：研究人员以碘帕醇API为模型，样品为Bracco Imaging SpA批号2470193的碘帕醇粉末（纯度99.8%，无辅料，总酵母/霉菌计数<1 CFU/g）。碘帕醇水溶液经氯仿液液萃取（liquid-liquid extraction, LLE），OTA提取前水相以0.1%三氟乙酸酸化，有机相氮吹后按毒素种类用15%或35%甲醇复溶；采用黄曲霉毒素总量与赭曲霉毒素总量/A+B+C商品化ELISA试剂盒检测。随后建立并验证UPLC-MS/MS方法，使用Waters HClass UPLC与Waters Xevo TQSμ三重四极杆质谱、电喷雾电离（ESI）正离子模式和多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）。OTA去除试验采用炭处理（55–60°C 2.5 h，继以40°C 2.5 h）、1/0.22 μm过滤并浓缩至50% w/w后分析。

3.1 提取程序（Extraction procedure）：利用碘帕醇高亲水（H₂O中>50% w/v）而AFs/OTA因芳香骨架疏水的差异，建立氯仿LLE；OTA水相轻度酸化以保证其非解离、更亲脂并更易进入有机相。后续回收和干扰试验验证了该提取程序。

3.2 ELISA方法（ELISA method）：对商品化试剂盒进行优化并用于碘帕醇中真菌毒素检测。3.2.1 赭曲霉毒素检测（Ochratoxin detection）：在碘帕醇50% w/v溶液中加标OTA AL（90 pg/g），酸化氯仿提取、有机相蒸发并以15%甲醇/Dilution Buffer I复溶至0.108 ppb；回收OTA 0.092±0.007 ppb，回收率79.7±6.3%，RSD 7.9%，处于70–130%（±10%）可接受范围；未加标提取/未提取碘帕醇及缓冲液均未干扰检测。结论：提取可有效回收OTA且未出现基质效应。3.2.2 黄曲霉毒素检测（Aflatoxin detection）：商业试剂盒标准曲线线性回归R²为0.82，因竞争ELISA结合位点饱和，改用AFB₁参考液（1.28–0.02 ppb）行非线性三参数拟合；加标AFB₁至AL（65 pg/g），提取后复溶至0.117 ppb，回收0.152±0.012 ppb，回收率130.1±9.9%，RSD 7.6%，原文判定处于70–130%（±10%）可接受范围；未提取未加标碘帕醇显示强假阳性（相对吸光度14.8±3.8），提取后未加标结果低于检出限（0.02 ppb）。结论：提取既浓缩样品又消除碘帕醇对AF检测的干扰。

3.3 UPLC-MS/MS方法（UPLC-MS/MS method）：按ICH分析方法验证指南考察系统精密度、选择性、灵敏度、提取准确度和基质效应。3.3.1 系统精密度（System Precision）：每批开始分析6份参考溶液（系统适用性试验）并于批末分析第7份（稳定性试验），OTA的RSD为2–14%、AFs为2–3%，满足<15%标准。3.3.2 选择性（Selectivity）：未加标碘帕醇提取物中未检出对应OTA或AFs MRM跃迁的干扰信号，保留时间区域不能与背景噪声区分。3.3.3 灵敏度试验（LoD）：OTA检出限为5 pg/mL（相当于碘帕醇中12.5 pg/g），信噪比（S/N）9–19；AFB₁和AFB₂为50 pg/mL（12 pg/g），AFG₁和AFG₂为100 pg/mL（25 pg/g），S/N 10–69，均满足>3。3.3.4 提取程序准确度（Accuracy of the extraction procedure）：20 mL 500 mg/mL碘帕醇加标OTA至90 pg/g，回收率100%；4 mL加标AF参考液至62 pg/g，四种AF回收率71–118%。3.3.5 基质效应（Matrix effect）：HPLC-UV分析（数据未显示）表明提取物中碘帕醇可忽略；AF提取物加标至250 pg/mL（62 pg/g）回收率80–118%，OTA未进行该实验。3.3.6 OTA去除后UPLC-MS/MS分析（UPLC-MS/MS analysis after OTA removal）：将未加标及加标OTA 900 pg/g（10倍AL）的碘帕醇溶液经炭处理、1/0.22 μm过滤并浓缩至50% w/w，二份分析均无OTA MRM信号；结论：该处理可将高污染OTA降至方法检出限以下，验证了UPLC-MS/MS用于药品中OTA监测的适用性。

讨论部分总结：真菌毒素因健康危害和经济损失成为全球问题，现有分析方法多针对食品基质，草药中真菌毒素已有较多研究，而API研究不足。欧洲药典规定总酵母/霉菌计数高于100 CFU/g或mL的API批次需返工/再处理并复检，美国药典亦有类似阈值；再处理通常为热灭菌或0.2 μm过滤，但真菌毒素难以被温度、化学或物理处理破坏，因此微生物灭活/去除后仍可能残留真菌毒素。在生物负载试验出现霉菌污染异常时，应考虑检测API中真菌毒素。本研究以高剂量、高体积给药的碘帕醇为挑战性API，优化并验证了ELISA和UPLC-MS/MS：ELISA快速、灵敏、成本低、易操作，经提取后可用于API；氯仿LLE因AFs/OTA易溶而碘帕醇几乎不溶，可有效分离。ELISA作为筛查方法，需更具选择性的UPLC-MS/MS以避免误判并完成分析验证；MRM仅监测特定离子的特定碎片，选择性高、噪声低，理论上可达pg/g级。验证方法具选择性、灵敏度和精密度，加标AL水平回收良好；并成功用于验证炭处理去除OTA（加标10倍AL后低于LoD），克服灭菌或过滤难以去除真菌毒素的问题。

研究结论（翻译）：据研究人员所知，这是首个在API中尝试真菌毒素检测的工作。研究提出两种方法，聚焦AFs和OTA：ELISA用于筛查，UPLC-MS/MS作为首选方法。只要采用适当的分析物提取方法以避免基质干扰，二者在灵敏度方面均适合检测碘帕醇API中AL水平的真菌毒素。基于研究结果，在罕见且持续的霉菌污染情况下，应实施API中真菌毒素存在检查；这在制药环境中并不常见。显然，所有程序均须根据待分析的具体API进行调整，尤其是提取程序。