靶向线粒体氧化还原信号促进多发性硬化模型神经再生与功能恢复

《Advanced Science》：Targeting Mitochondrial Redox Signaling Promotes Neuroregeneration and Functional Recovery in a Multiple Sclerosis Model

　　

包括多发性硬化（multiple sclerosis, MS）在内的神经退行性疾病，以进行性神经元丢失和有限的再生能力为特征。为通过利用疾病条件下中枢神经系统（central nervous system, CNS）中上调的内源性神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs）尚未开发的再生潜力来刺激体内神经发生（neurogenesis）和少突胶质细胞发生（oligodendrogenesis），研究人员开发了一种靶向Notch信号（一种已知抑制NPCs神经元分化的通路）的新型化合物。Furapyrrodole是通过筛选类天然产物合成化学文库鉴定得到的，它结合并激活线粒体还原酶CYB5R3，该酶在γ-分泌酶下游天然下调Notch信号。研究人员在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）小鼠（MS小鼠模型）中评估了furapyrrodole的体内疗效。在EAE疾病高峰期后给予furapyrrodole治疗，通过刺激内源性NPC来源的神经发生和少突胶质细胞发生，显著改善了运动功能，并促进了运动神经元和髓鞘的恢复。此外，furapyrrodole抑制CNS中的神经炎症。总之，这些发现表明furapyrrodole通过利用内源性上调的NPCs并诱导抗炎作用，是MS的一种有前景的治疗候选药物。本研究首次证明，调节线粒体氧化还原信号可在不引起严重不良效应的情况下促进神经再生和髓鞘再生。

论文解读：靶向线粒体氧化还原信号促进多发性硬化模型神经再生与功能恢复

多发性硬化（multiple sclerosis, MS）等神经退行性疾病以进行性神经元丢失和有限的再生能力为特征。中枢神经系统（central nervous system, CNS）中的神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs）在疾病状态下会上调，但这些内源性NPCs在体内难以分化为神经元。Notch信号通路是抑制NPCs神经元分化的关键通路，然而现有Notch抑制剂如γ-分泌酶抑制剂因脱靶效应而具有严重副作用。因此，研究人员旨在开发一种能够安全利用内源性NPCs再生潜能的药物。

研究人员通过筛选类天然产物合成化学文库，鉴定出一种新型螺环吲哚化合物furapyrrodole，它直接结合并激活线粒体还原酶CYB5R3，在γ-分泌酶下游抑制Notch信号。在MS小鼠模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）中，furapyrrodole在疾病高峰期后给药显著改善运动功能，促进运动神经元和髓鞘恢复，并抑制神经炎症。该研究首次证明调节线粒体氧化还原信号可促进神经再生和髓鞘再生，且不引起严重不良效应。相关成果发表于《Advanced Science》。

研究人员采用了以下关键技术方法：利用Notch报告基因筛选化学库并合成衍生物；通过pull-down联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定靶蛋白CYB5R3，并用细胞热转移分析（CETSA）、圆二色谱（CD）和分子对接验证结合；采用siRNA敲低、酶活性测定、JC-1线粒体膜电位检测和钙成像阐明信号机制；在C57BL/6J小鼠上用MOG_35-55肽诱导EAE模型，采用鞘内和腹腔注射评价药效；结合免疫组化、流式细胞术、细胞因子阵列、Nestin-RFP谱系追踪及逆行示踪评估神经发生、少突胶质细胞发生和抗炎作用；用AB-PAS染色评估肠道副作用。

研究结果如下：

2.1 Furapyrrodole是强效Notch信号抑制剂：通过荧光素酶报告基因筛选和结构优化得到furapyrrodole，其半数抑制浓度（IC₅₀）为13.1 μM；Western blot显示其降低HES1并升高ASCL1表达，证实功能抑制Notch信号。

2.2 Furapyrrodole靶向γ-分泌酶下游的CYB5R3：pull-down和LC-MS/MS鉴定CYB5R3为直接结合蛋白，竞争实验证实特异性；CETSA和CD光谱确认直接结合，解离常数（K_d）为3.8 μM；AlphaFold3预测结合在NADH结合口袋附近。

2.3 Furapyrrodole激活CYB5R3并调节线粒体氧化还原信号，通过Ca²⁺依赖的NICD核转位抑制Notch信号：CYB5R3敲低导致HES1上调，表明其负向调控Notch；furapyrrodole增强CYB5R3酶活性，升高线粒体膜电位，促进线粒体Ca²⁺摄取并降低胞质Ca²⁺，进而抑制钙调磷酸酶依赖的NICD核转位；使用thapsigargin升高胞质Ca²⁺可逆转其抑制效应。

2.4 Furapyrrodole促进NPCs向神经元和少突胶质细胞分化：在C17.2细胞中，furapyrrodole以浓度依赖方式增加Tuj1+神经元比例（10 μM时达60.8%），且效果优于DAPT；在EAE小鼠原代NPCs中，furapyrrodole增加神经元和PLP+少突胶质细胞比例，减少GFAP+星形胶质细胞；CYB5R3敲低可消除上述效应。

2.5 Furapyrrodole显著改善EAE小鼠运动功能并恢复运动神经元和髓鞘：EAE小鼠在20 dpi出现脊髓腹角运动神经元丢失和脱髓鞘；鞘内注射furapyrrodole（20–28 dpi）显著降低EAE临床评分，在40 dpi时增加ChAT+运动神经元数量和PLP+髓鞘面积。

2.6 Furapyrrodole在EAE条件下诱导NPC分化：EAE小鼠脊髓中央管nestin和CYB5R3表达显著上调，且CYB5R3高表达于nestin+ NPCs；furapyrrodole处理降低HES1、升高ASCL1；Nestin-RFP谱系追踪显示RFP信号从中央管迁移至腹角，部分RFP+细胞与ChAT共定位，提示其分化为运动神经元。

2.7 全身注射furapyrrodole通过促进神经发生和少突胶质细胞发生恢复EAE：LC-MS证实腹腔注射后药物可进入脊髓；在20–28 dpi腹腔注射1 mg/kg furapyrrodole同样显著改善EAE评分；RFP与ChAT、PLP共定位证实NPC分化为运动神经元和少突胶质细胞；逆行示踪显示部分新生运动神经元支配骨骼肌。

2.8 Furapyrrodole抑制脊髓神经炎症：细胞因子阵列显示，furapyrrodole降低脊髓中多种促炎介质（如几丁质酶3样1、C反应蛋白、ICAM-1等）水平；Iba1+小胶质细胞/巨噬细胞数量减少；脊髓中CD4⁺ T细胞和Th17细胞减少，但脾脏中未改变；CYB5R3在CNS微胶质细胞和CD4⁺ T细胞中高表达。

2.9 Furapyrrodole的不良反应较少：与γ-分泌酶抑制剂DAPT不同，furapyrrodole不引起肠道杯状细胞增生；CYB5R3在肠道干细胞中表达较低，这可能是其选择性高的原因。

讨论部分总结了该研究的创新点：furapyrrodole通过增强内源性CYB5R3活性来“微调”Notch信号，而非完全阻断，从而减少脱靶效应；CYB5R3在激活的NPCs中特异性高表达，而在肠道干细胞中低表达，有利于降低副作用。与现有MS治疗药物相比，furapyrrodole能同时促进神经再生和抗炎，且对脾脏外周免疫影响小。研究局限性包括CYB5R3激活的确切分子机制尚不明确，以及给药后体内细胞类型特异性分布有待进一步研究。

研究结论：本研究表明furapyrrodole通过激活CYB5R3调节线粒体氧化还原信号，抑制Notch信号，进而促进内源性NPCs的神经发生和少突胶质细胞发生，改善EAE小鼠神经功能，并抑制CNS神经炎症。这是首次证明调节线粒体氧化还原信号可促进神经再生和髓鞘再生，且不引起严重不良效应，使furapyrrodole成为MS及其他神经退行性疾病的有前景的治疗候选药物。