同电荷蛋白/纳米颗粒配对调控气-液界面组装行为

《Journal of Colloid and Interface Science》：Like-charged protein/nanoparticle pairing governs interfacial assembly at the air-water interface

　　

同电荷蛋白/纳米颗粒配对主导气-水界面的界面组装行为 摘要 流体界面在功能材料和生物系统中均扮演关键角色。在现代纳米科学中，控制纳米级物体（如聚合物和纳米颗粒（NP））在油-水或气-水界面形成的单层组装是一个核心挑战。本研究系统探究了约25 nm的负电荷二氧化硅纳米颗粒与三种模型蛋白——牛血清白蛋白（BSA）、β-乳球蛋白（BLG）和β-酪蛋白（BCN）——之间的相互作用，这三种蛋白在分子架构和构象柔性上存在显著差异，但在中性pH下具有相近的净负电荷。通过结合体相敏感技术（如圆二色光谱（CD）、分子荧光、动态及电泳光散射）与界面特异性测量（包括动态表面张力（DST）、掠入射小角X射线散射（GISAXS）、和频振动光谱（SFG）及气-水界面压缩等温线），研究人员在不同蛋白/纳米颗粒摩尔比条件下建立了体相溶液中蛋白-纳米颗粒相互作用与所得界面层的结构、堆积及力学之间的直接定量联系。研究结果表明，蛋白-纳米颗粒配对控制着蛋白的表面活性和取向，进而控制纳米颗粒的界面组装：结合强度、分子架构和构象适应性共同决定界面组织、纳米颗粒堆积密度及单层力学响应。这些发现为蛋白-纳米颗粒混合界面体系提供了基础性认识，并直接关联到Pickering乳液生物催化、刺激响应药物递送载体及食品级功能材料的理性设计。

同电荷蛋白/纳米颗粒配对调控气-水界面组装：蛋白质架构、结合强度与构象适应性的协同作用

一、研究背景与科学问题

流体界面在功能材料与生物系统中扮演着核心角色，控制纳米级物体在油-水或气-水界面的组装是现代纳米科学的核心挑战之一。由纳米颗粒（NP）在界面吸附形成的单层结构广泛涉及Pickering乳液、洗涤剂、食品、膜材料、传感器及可编程力学性能涂层等应用领域。在这些场景中，界面层的性能——包括稳定性、孔隙率、力学响应和功能性——关键取决于聚合物和颗粒如何吸附、堆积并在界面组织化。然而，实现对这些过程的理性控制仍然是一个未解决的开放问题。

蛋白质因其固有的两亲性、结构异质性、构象适应性和pH响应性，成为构建生物相容性复杂动态界面膜的理想选择。当蛋白质作为添加剂促进纳米颗粒界面组装时，体系的复杂性和功能性进一步扩展。蛋白-纳米颗粒体系已在食品级乳液稳定、生物催化Pickering体系及药物制剂中展现出应用前景。蛋白质并非界面上的被动旁观者：其分子架构、柔性及与纳米颗粒的结合亲和力共同塑造了体系在界面的吸附与重组行为。体相中蛋白-纳米颗粒相互作用与界面组装之间的这种关联，正是纳米医学中蛋白冠现象的核心，但这一关联如何转化为界面结构和力学性能，此前受到的关注相对有限。

已有少数关于混合蛋白-颗粒体系的研究表明，两种组分的协同效应可增强界面粘弹性并改善泡沫和乳液的抗聚结稳定性。蛋白质的结构在决定体相中蛋白-纳米颗粒相互作用强度以及所得界面层的组织方式中似乎起着关键作用。然而，关于蛋白质架构如何系统性地在分子水平上调控纳米颗粒在界面的吸附和堆积，仍缺乏深入理解。特别是，结合强度、蛋白质与纳米颗粒相互作用时结构扰动的程度以及蛋白质的构象适应性是否以及如何共同决定界面混合层的性质，此前尚不清楚。

建立这一联系的困难部分在于蛋白-纳米颗粒相互作用本身受竞争性分子力的微妙平衡支配。蛋白质在纳米颗粒表面的吸附源于静电相互作用、氢键、范德华力和疏水/熵贡献的组合。这些力的相对重要性强烈依赖于纳米颗粒表面化学性质。当蛋白质和纳米颗粒携带相同净电荷时（如本研究），静电作用尤为微妙：同电荷体系中，结合可通过带电斑块作为局部锚定点发生，这一机制不同于主导异电荷蛋白-纳米颗粒对的长程吸引。此外，蛋白质吸附到纳米颗粒后还可能发生结构重排，从局部再取向到部分去折叠不等，其程度取决于蛋白质的内在稳定性和纳米颗粒的尺寸及表面曲率。这些吸附诱导的结构变化不仅是体相现象，还预期直接影响蛋白质到达气-水界面后的行为，最终塑造界面层的结构和力学性能。

二、研究内容与主要结论

本研究系统探究了约25 nm负电荷二氧化硅纳米颗粒与三种模型蛋白——牛血清白蛋白（BSA）、β-乳球蛋白（BLG）和β-酪蛋白（BCN）——的相互作用。这三种蛋白在分子架构和构象柔性上差异显著，但等电点均高于5，且在中性pH下具有相近的净负电荷。研究人员结合体相敏感技术与界面特异性测量，在不同蛋白/纳米颗粒摩尔比条件下，建立了体相溶液中蛋白-纳米颗粒相互作用与界面层结构、堆积及力学之间的直接定量联系。

研究结果表明，蛋白-纳米颗粒配对控制着蛋白的表面活性和取向，进而控制纳米颗粒的界面组装：结合强度、分子架构和构象适应性共同决定界面组织、纳米颗粒堆积密度及单层力学响应。具体而言，BSA与纳米颗粒的强结合驱动混合纳米结构的共吸附；柔性BCN促进致密纳米颗粒界面单层的形成；而BLG与纳米颗粒的弱相互作用同时抑制纳米颗粒和蛋白质的界面组装。这些发现为蛋白-纳米颗粒混合界面体系提供了基础性认识，并直接关联到Pickering乳液生物催化、刺激响应药物递送载体及食品级功能材料的理性设计。

三、主要技术方法

研究人员综合运用了多种体相敏感和界面特异性技术。体相表征方面，采用圆二色光谱（CD）分析蛋白质二级结构及热稳定性，分子荧光光谱（激发波长280 nm和295 nm）研究三级结构变化和荧光猝灭，动态光散射（DLS）和电泳光散射（ELS）表征体系尺寸分布和ζ电位。界面表征方面，采用动态表面张力（DST）测量界面吸附动力学，掠入射小角X射线散射（GISAXS）定量界面纳米颗粒的间距和堆积结构，和频振动光谱（SFG）获取界面蛋白质分子构象和取向信息，以及压缩等温线测定界面膜的力学响应。此外，还通过透析实验定量蛋白质与纳米颗粒的结合强度。

四、研究结果

2.1 蛋白质二级结构和稳定性

CD光谱显示，游离BSA呈现典型的α-螺旋特征（222 nm和208 nm双极小值），游离BCN呈现无规卷曲特征（200 nm深极小值），游离BLG呈现高β-折叠含量特征（215 nm宽极小值）。添加同电荷纳米颗粒不诱导蛋白质聚集、沉淀或去折叠，但对不同蛋白质的二级结构产生不同影响。BSA随纳米颗粒含量增加出现α-螺旋减少、β-折叠和无规卷曲增加的重排，且热稳定性显著提高（熔点温度从约65°C升至75-84°C）。BCN始终保持无序构象，纳米颗粒不促进其有序化。BLG的二级结构基本不受纳米颗粒影响，热稳定性也无显著变化。

2.2 蛋白质三级结构和稳定性

荧光光谱显示，所有蛋白质在纳米颗粒存在下均发生荧光猝灭。BSA在280 nm激发时无最大发射波长移动，但在295 nm选择性激发色氨酸（Trp）时出现轻微红移，表明Trp 134参与与纳米颗粒的相互作用。BCN在两个激发波长下均无波长移动。BLG出现6 nm红移（337至343 nm），表明埋藏的芳香残基在纳米颗粒存在下暴露于水相环境。所有蛋白-纳米颗粒体系均无法通过变温荧光确定熔点温度，反映涉及蛋白-纳米颗粒相互作用减弱和蛋白质去折叠的复杂过程。

2.3 蛋白质与纳米颗粒的定量相互作用

BSA的Stern-Volmer图呈负偏离，表明存在两类色氨酸群体，其中可及荧光团分数约为0.6，与BSA中一个溶剂暴露Trp 134和一个埋藏Trp 213的分布一致。静态猝灭机制确认了BSA-纳米颗粒稳定体系的形成，结合常数（K_a）约为10³ M^-1，结合位点数n约为0.5。BCN的Stern-Volmer图为线性，但K_SV随温度升高而增大，表明同时存在动态碰撞猝灭。BLG的Stern-Volmer图呈正偏离，表明静态和动态猝灭共存。由于BCN和BLG的猝灭无法用单一机制描述，无法提取可靠结合常数。透析实验证实，BSA与纳米颗粒结合最强（仅约15%蛋白被洗脱），BCN中等（约50%被洗脱），BLG最弱（约75%被洗脱）。

2.4 蛋白-纳米颗粒体系的界面活性和结构

动态表面张力测量显示，所有三种蛋白质体系中，增加纳米颗粒浓度均导致稳态表面张力升高，表明纳米颗粒降低体系的整体界面效率。BCN体系的变化最为显著和急剧，在最低纳米颗粒浓度下表面张力即从约50 mN/m升至约60 mN/m。BLG呈现特征性的两步吸附行为，且随纳米颗粒浓度增加而逐渐减慢，表明弱BLG-纳米颗粒相互作用虽不足以促进共吸附，但有效降低了溶液中游离BLG的浓度。BSA和BCN体系则表现为单一快速表面张力下降后达到稳态。

GISAXS测量确认所有条件下均形成单层纳米颗粒结构。BSA体系中，增加纳米颗粒浓度导致中心到中心间距逐渐减小，形成更致密的单层。BCN体系呈现相同趋势但效果不如BSA显著，且BCN-纳米颗粒单层系统性地比BSA-纳米颗粒单层更致密（最低纳米颗粒浓度下间距约35 nm对约47 nm）。BLG行为显著不同：仅在较高纳米颗粒浓度（0.8%wt，1:1体相比）下检测到相关纳米颗粒域，且间距约42.5 nm，大于相同体相组成下BSA（约39 nm）和BCN（约34 nm）体系的间距，表明BLG在促进纳米颗粒界面吸附方面效率最低。

2.5 界面分子结构：SFG振动光谱

SFG光谱揭示了不同蛋白质-纳米颗粒体系在界面的分子级差异。BSA体系中，氢键界面水的O-H带振幅随纳米颗粒添加而增加，在中间BSA:NP比（约2:1）达到最大值后随纳米颗粒含量进一步增加而降低，这种非单调行为反映了界面对称性破缺程度的变化。酰胺I带从游离蛋白的约1658 cm^-1红移至纳米颗粒存在下的约1650 cm^-1，与更紧凑的氢键主链环境一致。羧酸根（COO^-）信号随纳米颗粒含量增加而降低，而质子化羧基（COOH）信号增加，表明酸性残基被重新取向并部分质子化。BCN体系的O-H信号随纳米颗粒含量增加而逐渐增强后保持恒定。BLG体系的SFG响应则表现出与弱蛋白-纳米颗粒相互作用一致的特征。

五、讨论与结论

研究结果表明，蛋白质的分子架构、结合强度和构象适应性三者协同决定蛋白-纳米颗粒体系的界面组装行为。BSA凭借其强结合能力和吸附诱导的结构重排，有效促进纳米颗粒的界面共吸附，形成致密但无序的单层结构。BCN凭借其固有的构象柔性和无序结构，无需显著结构变化即可高效促进纳米颗粒界面堆积，形成最致密的单层。BLG因与纳米颗粒的弱相互作用，既无法有效共吸附，又通过降低游离蛋白浓度间接抑制了蛋白质自身的界面吸附，导致纳米颗粒界面组装效率最低。

这些发现建立了体相蛋白-纳米颗粒相互作用与界面结构、堆积和力学之间的直接定量联系，为理解蛋白-纳米颗粒混合界面体系提供了分子层面的基础认识。该研究直接关联到Pickering乳液生物催化、刺激响应药物递送载体和食品级功能材料的理性设计，在这些应用中，在分子水平控制界面组装是释放体系性能的关键。