缺血性脑卒中后脑PDGFRβ+细胞呈现多样化反应表型且不依赖KLF4调控

《GLIA》：Brain PDGFRβ+ Cells Exhibit Diverse Reactive Phenotypes After Stroke Without Requiring KLF4

　　

缺血性脑卒中的病理生物学与脑血小板衍生生长因子受体（PDGFR）β+血管周围细胞的激活有关。尽管Krüppel样因子（KLF）4是外周PDGFRβ+细胞激活的公认介质，但其在脑PDGFRβ+细胞中的作用仍不清楚。本研究旨在表征脑PDGFRβ+细胞的时空反应性，同时利用转基因小鼠评估实验性缺血性脑卒中后KLF4的贡献，这些小鼠能够追踪PDGFRβ+细胞或在PDGFRβ+细胞中条件性敲除KLF4。为了超越定性描述，研究人员开发了点模式分析（PPA）和拓扑数据分析（TDA）工作流程，以生成稳健且可重复的数学模型来评估空间细胞反应和组织瘢痕拓扑变化。首先，研究人员报告了表型不同的反应性实质PDGFRβ+细胞的涌现，这些细胞不能像目前所提出的那样，被因果且排他性地与局部细胞增殖或邻近血管脱离联系起来。此外，研究人员表明，在正常条件下，KLF4在大脑PDGFRβ+细胞中几乎不表达，并且在受损大脑的反应性PDGFRβ+细胞中也仅被轻微诱导。值得注意的是，特异性在反应性PDGFRβ+细胞中条件性减弱KLF4表达并不会改变空间细胞分布或瘢痕组织。这表明，与外周PDGFRβ+细胞在缺血性损伤后的反应相反，KLF4并非脑细胞响应缺血性脑卒中反应性的主要调节因子。最终，研究人员的发现得到了开源时空模型的支持，表明脑PDGFRβ+血管周围细胞的反应性是高度异质的，并且与外周PDGFRβ+细胞根本不同。

脑缺血损伤后PDGFRβ⁺细胞的异质性反应与KLF4的非依赖性调控

一、研究背景与科学问题

缺血性脑卒中（ischemic stroke）会引发高度有序的多细胞级联反应，最终形成由胶质瘢痕（glial scar）包裹纤维化核心（fibrotic core）的清晰边界。位于神经血管界面的血小板衍生生长因子受体β阳性（platelet-derived growth factor receptor β⁺, PDGFRβ⁺）血管周围细胞（perivascular cells）是应对多种病理信号的首批效应细胞之一。现有理论认为，缺血性脑卒中后，PDGFRβ⁺血管周围细胞迅速从相邻血管脱离、发生大量局部增殖并向梗死核心迁移，从而主导纤维化反应并为胶质瘢痕的组织提供空间线索。然而，调控脑内PDGFRβ⁺细胞激活、表型转变及大规模重组的精确时空机制仍未完全阐明。

在外周器官中，锌指转录因子Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4, KLF4）是驱动PDGFRβ⁺细胞对缺氧、缺血及纤维化刺激产生反应的关键因子，参与调节细胞重编程、去分化及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）蛋白的释放。由于KLF4介导的调控过程被认为在所有PDGFRβ⁺细胞群体中是保守的，因此其是否同样参与调节脑PDGFRβ⁺血管周围细胞在缺血性脑卒中后的反应性，是一个亟待解答的核心问题。鉴于脑PDGFRβ⁺细胞起源于神经外胚层，与外周器官中起源于中胚层的同类细胞发育起源不同，这种差异可能预示着截然不同的调控机制。

二、研究设计与主要技术方法

为探究上述问题，研究人员采用转基因小鼠模型：利用PDGFRβ^tdTomato报告小鼠追踪PDGFRβ⁺细胞，并通过PDGFRβ^KLF4-KO小鼠条件性下调PDGFRβ⁺细胞中的KLF4表达。所有小鼠均接受30分钟的大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAo）手术以建立局灶性缺血性脑卒中模型。关键技术方法包括：(1) 空间点模式分析（Point Pattern Analysis, PPA），基于spatstat包量化细胞的空间排列与相对分布；(2) 拓扑数据分析（Topological Data Analysis, TDA），利用Gudhi和Ripser库提取细胞点云的持续性同调特征，计算贝蒂曲线（Betti curves）及Wasserstein/Bottleneck距离；(3) 贝叶斯统计建模，采用马尔可夫链蒙特卡洛（Markov Chain Monte Carlo, MCMC）方法通过brms包进行参数估计与推断；(4) 无偏自动细胞检测，结合QuPath、CellProfiler及Ilastik实现高通量图像分析与共定位量化。

三、主要研究结果

3.1 星形胶质细胞与PDGFRβ⁺细胞对缺血性脑卒中的反应不同

通过测量缺血半球萎缩面积，研究人员发现从第7天至约第20天，脑萎缩以每天0.34 mm²的速度进展，到30天时体积减少约46%。在此动态微环境中，PDGFRβ⁺细胞的积分密度（integrated density, IntDen）呈非线性增加直至第3周后进入平台期，而GFAP⁺星形胶质细胞的IntDen在第2周达到峰值后即进入消退期。条件于半球面积的模型预测显示，脑萎缩有利于反应性PDGFRβ⁺细胞的涌现，而对GFAP⁺细胞分布影响不大。

3.2 高反应性PDGFRβ⁺细胞聚集于内层瘢痕区室

利用机器学习分类器将PDGFRβ⁺细胞分为PDGFRβ^high（高反应性）和PDGFRβ^low（静息态）两个亚群。PPA分析揭示，PDGFRβ^high细胞在急性/亚急性期明确聚集于GFAP⁺细胞形成的凸包之外，即不可逆退化的损伤区域，而在轻度纹状体特异性损伤中这种空间分离现象消失，表明PDGFRβ^high细胞的强烈聚集是严重组织损伤的特异性微结构标志。

3.3 反应性PDGFRβ⁺细胞包含血管周细胞和实质细胞

在健康脑组织中，实质非血管关联的PDGFRβ⁺细胞概率仅为3%~9%，而在损伤第2周，此值在损伤纹状体升至约25%、在损伤皮层升至约50%。流式细胞术（fluorescence-activated cell sorting, FACS）数据表明，定植于核心区的反应性PDGFRβ⁺细胞高度易死亡。在轻度损伤中，实质PDGFRβ⁺细胞的概率持续上升，与重度损伤中的下降趋势形成鲜明对比，证实PDGFRβ⁺细胞的损失程度与损伤严重性直接相关。

3.4 反应性PDGFRβ⁺细胞在损伤脑内并未大量增殖

与既往抗体研究的报道相反，本研究发现PDGFRβ⁺/Ki67⁺双阳性细胞的比例峰值（3天时）仅为约7.21%，远不足以解释损伤部位PDGFRβ⁺细胞密度的显著增加。共聚焦显微镜分析进一步确认，少量增殖的PDGFRβ⁺/Ki67⁺细胞主要来源于损伤皮层的非血管关联细胞。这提示实质增殖性PDGFRβ⁺细胞的来源可能涉及血管脱离或外周浸润细胞招募。

3.5 反应性PDGFRβ⁺细胞包含形态多样的群体

通过半自动化计算管道的主成分分析（principal component analysis, PCA），研究人员鉴定出四种形态学上不同的PDGFRβ⁺细胞亚型：(1) 血管周细胞，锚定于CD31⁺血管，分支长度一致；(2) 网状实质细胞，胞体位于实质但与血管通过细突相互作用，核周CD13阴性；(3) 网状小细胞，主要位于缺血纹状体，呈中等强度的小分支形态，CD13免疫阳性；(4) 阿米巴样细胞，主要见于缺血皮层，PDGFRβ活性高，既可锚定血管也可游离于实质。

3.6 反应性PDGFRβ⁺细胞的空间与拓扑组织

Haralick纹理特征分析显示，损伤皮层的逆差矩（inverse difference moment, IDM）升高，反映PDGFRβ⁺细胞占据区域的均质性增加；而病灶周围区域则呈现高熵值和复杂纹理。TDA结果表明，纹状体中反应性PDGFRβ⁺细胞在第1~2周形成均匀的大规模互联单层；而在皮层，成熟纤维化瘢痕从第2周起稳步建立，表现为小尺度细胞簇快速形成单层，此后不再发生显著重组。

3.7 缺血性脑卒中后KLF4表达在损伤脑中被诱导

PPA显示，整体KLF4免疫反应性在损伤早期（3天）下降，随后逐渐恢复至慢性期（30天）。单细胞核强度分析表明，KLF4染色强度从3天至14天增加，且靠近背外侧皮层的细胞核强度更高。PDGFRβ/KLF4共定位分析估计假阳性率为5%~10%，扣除后，损伤皮层中最多约20%的PDGFRβ⁺细胞在30天时显示可检测的KLF4表达，表明其在反应性PDGFRβ⁺细胞中的诱导非常微弱。

3.8 缺血性脑卒中后KLF4在反应性PDGFRβ⁺细胞中的诱导极小

在PDGFRβ^KLF4-KO小鼠中，条件性下调PDGFRβ⁺细胞中的KLF4表达后，损伤侧半球的整体KLF4空间强度与对照组无显著差异，进一步证实KLF4在反应性PDGFRβ⁺细胞中的表达水平极低，不足以在全脑尺度上产生可测量的影响。

四、讨论与结论

综合以上结果，本研究通过引入PPA和TDA等开源定量空间分析工具，揭示了脑PDGFRβ⁺血管周围细胞在缺血性脑卒中后呈现出高度的表型异质性和独特的空间拓扑重组模式。与目前主流观点不同，研究人员发现：(1) 反应性PDGFRβ⁺细胞的出现不能归因于大规模的局部增殖或简单的血管脱离；(2) KLF4在脑PDGFRβ⁺细胞中基础表达极低，且在损伤后仅被轻微诱导；(3) 条件性敲除KLF4并不影响PDGFRβ⁺细胞的空间分布或瘢痕组织结构。研究结论明确指出：与外周器官中PDGFRβ⁺细胞对缺血性损伤的反应相比，KLF4并非脑内PDGFRβ⁺细胞反应性的主要调控因子。脑PDGFRβ⁺血管周围细胞的反应性本质上是高度异质的，并且与外周同类细胞存在根本性差异。这一发现挑战了KLF4调控机制在不同组织PDGFRβ⁺细胞中保守的假设，并为理解中枢神经系统特有的损伤修复机制开辟了新方向。