母源与合子型sox17突变对斑马鱼小胶质细胞丰度的复合效应研究

《GLIA》：sox17 Mutagenesis Reveals Compounding Effects ofMaternal and Zygotic Contribution on Microglia Abundance

　　

胚胎发育受母源因子和合子型因子的共同塑造，但这两类因子之间的相互作用如何促成表型变异并影响特定脑细胞群体，进而影响神经发育，在很大程度上仍属未知。本研究揭示了一种影响发育中小胶质细胞及其前体细胞的“双重打击”现象。研究人员利用斑马鱼，鉴定出sry相关HMG盒基因17（sox17）的一个突变，该突变表现出母源效应表型，即脑中小胶质细胞和卵黄囊中前体细胞减少。研究证明，与杂合亲本所生的纯合后代相比，纯合亲本所生的纯合后代小胶质细胞缺陷更为严重，提示母源与合子型sox17突变对小胶质细胞丰度具有复合效应。研究人员观察到sox17在小胶质细胞和卵黄囊前体细胞中表达，且存在母源贡献。在胚胎发生期间注射sox17 RNA足以挽救小胶质细胞和卵黄囊细胞的丰度。为鉴定与sox17相互作用的额外基因，研究人员利用CRISPR诱变进行遗传筛选，鉴定出f11r.1、gas6和mpp1为小胶质细胞调控因子，并证明这些基因在斑马鱼小胶质细胞中表达。针对这些基因的转录组和突变体分析提示，sox17正向调控mpp1的转录。这些结果表明，小胶质细胞对母源与合子型sox17突变的叠加效应敏感，且后代对小胶质细胞缺陷的易感性因母体基因型的不同而存在显著差异。研究结果强调，在检查可能由小胶质细胞功能障碍引起的神经发育障碍时，应同时考虑母体和后代的基因型。

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一、研究背景与科学问题

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中重要的免疫细胞，起源于胚胎卵黄囊的原始造血位点，在发育过程中迁移至脑实质并发挥多种功能。小胶质细胞的发育和维持受到特定基因的时空协调调控，近年研究揭示小胶质细胞具有显著的异质性，存在多个基因表达、定位和功能各异的亚群。然而，调控这些亚群的遗传机制，尤其是发育过程中的调控机制，仍 largely 未知。

胚胎发育同时受母源因子和合子型因子的影响。母源效应基因通过母体向卵子贡献的RNA或蛋白质发挥作用，在合子基因组激活前调控早期发育。母源与合子型因子的相互作用如何影响特定脑细胞群体，特别是小胶质细胞，此前尚无系统研究。sry相关HMG盒基因17（sox17）是内胚层发育和胎儿造血干细胞维持的关键转录因子，其严重突变在哺乳动物中导致胚胎致死，但人类的亚致死SOX17变异与先天性肾脏、泌尿道、心脏和肺部异常相关。鉴于sox17在造血系统中的重要性，研究人员推测其突变可能影响小胶质细胞的个体发生，并可能涉及母源效应的参与。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用斑马鱼模型，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了模拟人类SOX17变异的亚致死sox17突变体（sox17^nt206，8碱基缺失导致C端截短）。研究发现，sox17突变对小胶质细胞丰度的影响呈现显著的母源-合子型“双重打击”效应：母源合子型纯合突变体（MZ?/?）脑中总小胶质细胞（4C4⁺）数量显著减少，而仅合子型纯合突变（zyg?/?）不影响总小胶质细胞数量。对于mrc1a⁺；4C4⁺小胶质细胞亚群，母源sox17缺失（MZ+/?和MZ?/?）均导致其丰度显著降低，且该效应持续至至少14 dpf。研究证实sox17为母源贡献基因，在1 hpf（合子基因组激活前）胚胎中可检测到sox17转录本。卵黄囊中mrc1a⁺和pu1⁺细胞（小胶质细胞前体）在母源sox17缺失时数量减少，而sox17 RNA注射可挽救脑内小胶质细胞和卵黄囊细胞的丰度。通过高通量CRISPR筛选，研究人员鉴定出f11r.1、gas6和mpp1为新的小胶质细胞调控因子，并发现sox17正向调控mpp1转录。

三、主要技术方法

研究人员主要运用以下关键技术：1）CRISPR/Cas9基因编辑技术构建sox17亚致死突变体及进行反向遗传筛选，利用T7核酸内切酶实验确认基因编辑效率；2）转基因斑马鱼品系（Tg(mrc1a:GFP)、Tg(pu1:Gal4;UAS:GFP/TagRFP)、Tg(sox17:H2A-mCherry)）结合4C4抗体免疫染色进行小胶质细胞亚群标记与定量分析；3）共聚焦显微镜成像及自建高通量自动化成像机器人进行大规模表型筛选；4）全胚原位杂交链式反应（HCR）检测sox17、mpp1等基因的转录表达；5）母源RNA注射回补实验验证sox17的母源功能；6）利用已发表的E14.5小鼠胚胎小胶质细胞单细胞RNA测序数据（Hammond et al.）进行候选基因提名。

四、研究结果

4.1 sox17突变降低发育中脑内小胶质细胞丰度

通过注射Cas9和靶向sox17两个外显子的gRNA构建sox17 crispants，在4 dpf斑马鱼中脑检测到4C4⁺小胶质细胞数量较对照组显著减少（13.24±1.15 vs 20.32±1.29），mrc1a⁺；4C4⁺小胶质细胞同样减少，证明亚致死sox17扰动可影响胚胎小胶质细胞丰度。

4.2 母源合子型“双重打击”突变影响胚胎小胶质细胞丰度

利用稳定的sox17^nt206突变体进行不同遗传交配组合，发现MZ?/?突变体总4C4⁺小胶质细胞显著减少（15.49±0.60 vs 野生型25.07±0.72），而zyg?/?和PZ+/?无显著变化。MZ+/?和MZ?/?的mrc1a⁺；4C4⁺小胶质细胞均显著减少，但pu1⁺；4C4⁺小胶质细胞在MZ+/?中不受影响，表明母源sox17缺失对mrc1a⁺亚群具有特异性影响。

4.3 sox17突变不影响BAMs或脑血管

对4 dpf斑马鱼脑相关巨噬细胞（BAMs）的定量分析显示，各基因型间BAM数量无显著差异。对中脑静脉长度、中脑血管长度、血管环面积及GFP⁺信号覆盖百分比等血管参数的测量也未发现sox17突变引起的血管模式缺陷，排除血管异常作为小胶质细胞减少的间接原因。

4.4 胚胎小胶质细胞表达sox17

利用Tg(sox17:H2A-mCherry)报告基因品系，发现4 dpf野生型脑中4.5%±1.45%的mrc1a⁺；4C4⁺小胶质细胞和7.8%±3.16%的pu1⁺；4C4⁺小胶质细胞表达sox17，证实sox17在胚胎小胶质细胞中表达。

4.5 母源与合子型sox17突变组合降低表达sox17转录本的mrc1a⁺细胞比例

通过HCR原位杂交检测4 dpf各基因型脑中mrc1a⁺细胞中sox17转录本表达比例，MZ?/?突变体中仅17.04%±2.98%的mrc1a⁺细胞表达sox17，显著低于野生型的60.14%±3.03%，表明双重打击效应持续影响sox17转录本表达至4 dpf。

4.6 sox17突变体细胞增殖、细胞死亡及mrc1a表达无差异

对4 dpf野生型、MZ+/?和MZ?/?动物的mrc1a⁺小胶质细胞进行活化Caspase 3和增殖细胞核抗原（PCNA）染色，各基因型间细胞凋亡和增殖比例均无显著差异。qPCR检测显示mrc1a转录水平在各基因型间无差异，排除报告基因表达下降作为表型原因。

4.7 sox17 MZ?/?突变体小胶质细胞丰度减少持续至至少14 dpf

在14 dpf时，MZ?/?突变体总4C4⁺小胶质细胞（10.42±0.91 vs 野生型15.24±10.42）和mrc1a⁺；4C4⁺小胶质细胞（7.83±0.62 vs 野生型10.52±1.16）仍显著减少，但sox17转录本表达比例已恢复至野生型水平，提示转录水平的母源效应在4 dpf后得到解决。

4.8 sox17母源贡献至后代

在1 hpf（合子基因组激活前）的野生型和MZ?/?胚胎中均检测到sox17 mRNA，证实sox17为母源装载基因，且多个繁殖雌鱼均存在母源贡献。

4.9 sox17突变体卵黄囊中小胶质细胞前体减少

1 dpf时，MZ+/?和MZ?/?突变体卵黄囊中mrc1a⁺细胞数量较野生型显著减少（4.56±0.65和4.32±0.44 vs 7.74±1.21），MZ+/?的pu1⁺细胞也显著减少（1.28±0.31 vs 7.33±2.16），表明母源sox17缺失足以破坏卵黄囊中两类前体细胞的丰度。

4.10 卵黄囊中mrc1a⁺细胞表达sox17

1 dpf野生型卵黄囊中38.20%±9.81%的mrc1a⁺细胞和21.27%±3.31%的pu1⁺细胞表达sox17，MZ+/?中mrc1a⁺细胞表达sox17的比例有下降趋势（19.47%±5.13%）。

4.11 sox17回补恢复脑内mrc1a⁺小胶质细胞和卵黄囊细胞丰度

在单细胞期向MZ?/?胚胎注射sox17-P2A-mCherry-pA RNA，4 dpf时总4C4⁺小胶质细胞恢复至23.23±0.96（与野生型无差异），mrc1a⁺；4C4⁺小胶质细胞恢复至17.14±0.83；1 dpf时卵黄囊mrc1a⁺细胞增加至14.3±1.96，证明在母源贡献时间点补充sox17足以逆转双重打击效应。

4.12 高通量CRISPR筛选鉴定小胶质细胞发育的新遗传修饰因子

利用自建自动化共聚焦成像机器人，对基于小鼠E14.5胚胎小胶质细胞单细胞RNA测序数据提名的24个候选基因进行CRISPR筛选，初步鉴定出6个候选基因（cmtm7、cndp2、f11r.1、gas6、irf8、mpp1）在敲除后导致脑内mrc1a⁺细胞减少。

4.13 筛选命中基因验证

经T7核酸内切酶确认基因编辑效率并排除未发生indel的个体后，f11r.1、gas6和mpp1 crispants的mrc1a⁺；4C4⁺小胶质细胞数量显著减少，验证了这三个基因为小胶质细胞丰度的新调控因子。

4.14 sox17突变改变mrc1a⁺小胶质细胞中的转录

在MZ?/?背景下分别敲除f11r.1、gas6或mpp1，未观察到小胶质细胞数量的进一步减少，提示这些基因可能与sox17通过共享机制调控mrc1a⁺小胶质细胞丰度。HCR共表达分析显示，MZ?/?突变体中mrc1a⁺细胞共表达sox17和mpp1转录本的比例显著降低（15.25%±4.57% vs 野生型66.69%±11.79%），且mrc1a⁺细胞中mpp1表达比例也显著下降（34.33%±6.75% vs 75.00%±11.32%），支持sox17正向调控mpp1转录。

4.15 mpp1扰动不影响BAM丰度

mpp1 crispants的BAM数量与对照组无差异，表明mpp1对小胶质细胞的影响具有细胞类型特异性。

五、讨论与结论

本研究首次揭示sox17作为母源效应基因在小胶质细胞发育中的关键作用，证明了母源与合子型sox17突变的“双重打击”效应对小胶质细胞丰度的复合影响。研究发现，母源sox17缺失即使在后代具有完整合子型sox17基因的情况下（MZ+/?），也足以导致mrc1a⁺小胶质细胞亚群丰度显著降低，且该效应持续至发育后期。研究通过RNA回补实验证实了sox17母源功能的可挽救性，并通过遗传筛选鉴定出f11r.1、gas6和mpp1为新的小胶质细胞调控因子，其中sox17正向调控mpp1转录。

研究结论强调，小胶质细胞对母源和合子型sox17突变的叠加效应高度敏感，后代的易感性因母体基因型的不同而存在显著差异。这一发现提示，在检查可能由小胶质细胞功能障碍引起的神经发育障碍时，应同时考虑母体和后代的基因型，为理解神经发育疾病的遗传基础提供了新的视角，也凸显了母源效应在终末分化细胞（如小胶质细胞）发育中的重要性。