《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Ixodes ricinus-Contact Phase Inhibitor Promotes Functional Recovery and Attenuates Neutrophil Associated Neuroinflammation After Experimental Intracerebral Hemorrhage
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目的：中性粒细胞相关炎症参与了脑出血后的继发性脑损伤。本研究评估了Ixodes ricinus-接触相抑制剂，一种选择性凝血因子XIa/XIIa抑制剂，具有血栓炎症调节特性，是否能改善实验性脑出血后的预后而不加重出血。
方法：在胶原酶诱导的小鼠脑出血模型中，研
目的：中性粒细胞相关炎症参与了脑出血后的继发性脑损伤。本研究评估了Ixodes ricinus-接触相抑制剂，一种选择性凝血因子XIa/XIIa抑制剂，具有血栓炎症调节特性，是否能改善实验性脑出血后的预后而不加重出血。
方法：在胶原酶诱导的小鼠脑出血模型中，研究人员以静脉推注给药Ir-CPI，随后进行为期3天的持续输注。以溶剂处理动物作为对照，依诺肝素作为抗凝剂对照。研究队列评估了出血和病灶体积、内皮激活、中性粒细胞相关炎症以及纵向功能恢复。在体外评估了Ir-CPI与人中性粒细胞的结合情况。
结果：与PBS相比，Ir-CPI在第14天内未增加出血或病灶体积，而依诺肝素在第1天显示出比Ir-CPI更高的出血体积。流式细胞术显示Ir-CPI与人中性粒细胞结合。在小鼠模型中，Ir-CPI在中性粒细胞浸润和NET形成方面产生了区域特异性减少，并在注射部位和尾侧水平减少了神经元变性，但不影响VCAM-1相关的内皮激活。Ir-CPI加速了功能恢复，在第5天改善了神经学评分和感觉运动不对称性，到第14天恢复了基线角测试表现。
结论：Ir-CPI在不加重出血的情况下改善了实验性脑出血后的恢复，并与减少的中性粒细胞相关继发性脑损伤有关。这些发现支持其作为脑出血治疗策略的转化潜力。
论文解读：Ir-CPI在实验性脑出血中的保护作用及机制
一、研究背景与科学问题
脑出血是卒中中最严重的亚型，在高收入国家约占所有卒中的10%-15%，却不成比例地贡献于卒中死亡率。存活者常遗留持续性神经功能障碍，仅有不到五分之一的患者在6个月时恢复功能独立性。目前的急性期管理集中于稳定病情、控制血压、逆转凝血障碍、预防并发症和处理占位效应，尚无疾病修饰性药物疗法能一致性地改善脑出血后的功能结局。
脑出血后继发性脑损伤由相互关联的过程驱动，包括神经炎症、红细胞溶解和凝血酶激活，这些过程均促进血脑屏障破坏、血肿周围水肿和神经元死亡。中性粒细胞是脑出血后最早被募集的免疫细胞之一，在实验模型中约第3天达到峰值。它们通过释放中性粒细胞胞外陷阱加剧炎症、破坏血脑屏障完整性并加重神经元损伤。此外，NET成分促进凝血和微血管功能障碍，将炎症与血栓形成联系起来。因此，靶向中性粒细胞驱动的炎症成为减轻继发性脑损伤的一个有前景的治疗方向。
Ir-CPI是一种源自蓖麻硬蜱唾液的小蛋白，选择性抑制凝血因子XIa和XIIa，在临床前模型中表现出强效抗血栓功效而不损害止血功能。鉴于中性粒细胞驱动的炎症在继发性脑损伤中的重要作用、凝血与炎症之间的密切联系以及对保持出血稳定性的治疗需求，研究人员测试了Ir-CPI能否在不增加出血的情况下改善脑出血后的恢复。
二、主要技术方法
研究人员采用胶原酶诱导的小鼠脑出血模型，通过立体定位注射细菌胶原酶至右侧纹状体建立模型。治疗组以静脉推注加连续输注方式给予Ir-CPI共69小时，以PBS为溶剂对照组，依诺肝素为抗凝剂比较组。使用7T磁共振成像在多个时间点评估出血和病灶体积。采用靶向VCAM-1的抗体偶联铁颗粒进行分子MRI评估内皮细胞活化。通过免疫荧光染色检测Ly6G、MPO和瓜氨酸化组蛋白H3共定位评估中性粒细胞浸润和NET形成。使用Fluoro-Jade C染色评估神经元变性。通过角测试和改良Bederson评分评估神经行为功能。在人全血样本中使用流式细胞术评估Ir-CPI与中性粒细胞的结合。
三、研究结果
3.1 Ir-CPI保持出血稳定性且不加重脑出血后病灶演变
在队列A中，出血和病灶体积均显示出显著的时间效应。出血体积还显示出治疗效应，但无时间与治疗的交互作用。第1天，依诺肝素的出血体积高于Ir-CPI，而Ir-CPI与PBS无差异。第3天各组间无差异。病灶体积方面，依诺肝素在第1天高于Ir-CPI，第3天无差异。在队列B中，时间对出血和病灶体积均有显著影响，但无显著治疗效应或交互作用。两组小鼠的出血和病灶体积均随时间逐渐减小，而Ir-CPI与PBS在各时间点均无差异。这表明Ir-CPI保持了出血稳定性，未加重早期或延迟性病灶演变。
3.2 Ir-CPI不调节VCAM-1相关内皮激活
脑出血后双侧半球的VCAM-1相关MPIO信号均升高，同侧半球信号高于对侧。各组间在任一半球或全脑水平的VCAM-1相关MPIO信号均无显著差异，表明Ir-CPI未改变VCAM-1相关的内皮活化状态。
3.3 Ir-CPI与中性粒细胞呈强结合
流式细胞术显示，Ir-CPI与人类中性粒细胞呈现强且一致的结合，各供体中超过98%的中性粒细胞为Ir-CPI阳性。小鼠静脉内的活体成像也显示了Ir-CPI相关荧光信号与小鼠中性粒细胞的空间关联。
3.4 Ir-CPI减少出血脑组织中的中性粒细胞浸润和NET释放
第3天，PBS组小鼠观察到明显的炎症浸润。MPO阳性细胞密度在各组和各区域相似。相比之下，Ly6G染色显示PBS小鼠中明显的中性粒细胞积聚。Ir-CPI在吻侧水平显著减少了Ly6G阳性中性粒细胞，在注射部位有非显著性减少趋势。三个采样水平的平均Ly6G阳性计数在Ir-CPI组低于PBS组。NET分析显示，Ir-CPI在注射部位显著减少了NET释放的中性粒细胞，在吻侧水平有非显著性减少趋势。依诺肝素未显著改变中性粒细胞浸润或NET释放。
3.5 Ir-CPI减轻脑出血后神经元变性
在注射部位和尾侧水平，Ir-CPI组FJC阳性细胞核的比例显著低于PBS组，吻侧水平无差异。DAPI阳性细胞核密度在各组间无显著差异。
3.6 Ir-CPI加速脑出血后功能恢复
基线时各组神经功能相当。第1天，两个脑出血组均出现显著神经功能缺损，严重程度相当。第5天，Ir-CPI组的Bederson评分显著低于PBS组，角测试表现也显著优于PBS组。Ir-CPI小鼠在第1天至第5天之间角测试表现显著改善，而PBS组未见此改善。到第14天，两组在两项测试中不再有显著差异，但Ir-CPI组角测试恢复到基线水平，而PBS组仍显著受损。
四、讨论与结论
本研究确定Ir-CPI是一种出血安全的治疗候选物，可改善实验性脑出血后的功能恢复并减轻中性粒细胞相关的继发性脑损伤。保持出血稳定性是这些发现治疗相关性的核心。Ir-CPI选择性抑制XIa/XIIa因子，不增加任何时间点的出血体积，这与接触/内源性通路抑制可在减少血栓形成的同时保持止血功能的既往证据一致。
继发性脑损伤被认为是脑出血后预后的主要决定因素，血肿周围水肿扩张、神经炎症和血脑屏障破坏是重要贡献因素。中性粒细胞在脑出血后迅速浸润脑组织，约第3天达峰，发挥关键致病作用。Ir-CPI产生了区域特异性的中性粒细胞募集和NET释放减少，支持其在调节已知会加重继发性脑损伤的早期中性粒细胞效应机制中的作用。
流式细胞术证实Ir-CPI与人类中性粒细胞强结合，虽然涉及的分子伴侣尚不清楚，需进一步研究。NET已成为连接缺血性和出血性卒中中炎症与凝血的关键介质。通过选择性抑制FXIIa和FXIa，Ir-CPI可能破坏这种凝血-炎症放大环路，限制NET驱动的损伤扩大。
Ir-CPI未改变VCAM-1相关内皮激活，提示中性粒细胞募集的减少不能仅用内皮活化变化解释。Ir-CPI可能在血管和局部位点同时发挥作用，其对循环和粘附中性粒细胞的结合支持血管内相互作用，而胶原酶诱导的血管和血脑屏障破坏可能使Ir-CPI到达出血环境。
神经元死亡由机械损伤、兴奋毒性、氧化应激和炎症信号共同驱动。虽然研究设计无法确立直接因果关系，但中性粒细胞活化减少、NET释放降低和FJC阳性率降低之间的一致性，与Ir-CPI治疗后继发性神经元变性减轻相符。
功能恢复是出血性卒中临床最相关的结局。Ir-CPI显著改善了感觉运动不对称性和神经功能缺损，在第1天至第5天之间加速恢复，到第14天使精细感觉运动功能更完全恢复。静脉给药途径与当前急性卒中护理框架兼容，可在诊断后尽快启动。尽管治疗在第3天停止，功能获益持续至第14天，表明短期调节早期继发性损伤级联反应可产生持久的恢复效果。
研究结论：Ir-CPI在不加重出血的情况下改善了实验性脑出血后的恢复，并与减少的中性粒细胞相关继发性脑损伤有关。这些发现支持其作为脑出血治疗策略的转化潜力。
