病毒学抑制HIV感染者脑脊液细胞因子表达特征及其与神经影像学、神经心理学和神经退行性测量的关系

《Annals of Neurology》：Cerebrospinal Fluid Cytokine Expression and Relationships With Neurological Measures in Virologically Controlled People With HIV

　　

**Objective**：量化病毒学抑制的人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者（people with HIV, PWH）和未感染HIV者（people without HIV, PWoH）脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中的细胞因子，并分析其与神经影像学、神经心理学（neuropsychometric, NP）及神经退行性测量的相关性。
**Methods**：研究人员在自然病史方案下收集了病毒学抑制的PWH和人口统计学匹配的PWoH的CSF样本。参与者在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）接受了年度腰椎穿刺、磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）脑扫描和NP测试。采用磁珠检测法（magnetic bead assay）测量了来自82名PWH和25名PWoH的136份PWH和30份PWoH CSF样本中的30种细胞因子浓度。
**Results**：13种细胞因子——IP-10/CXCL10、G-CSF、GM-CSF、IL-7、IL-1ra、IL-1α、MIP-1β/CCL4、IL-15、TNF-α、IFN-α2、IL-10、IL-8/CXCL8和IL-β——在PWH的CSF中较PWoH显著升高（p < 0.05）。另有5种升高，1种降低（p = 0.05–0.10）。7种细胞因子（EGF、IL-15、IL-6、IP-10/CXCL10、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3和TNF-α）与白质病变（white matter lesion, WML）负担呈正相关，4种（eotaxin/CCL11、G-CSF、GM-CSF和IL-1ra）与白质体积（white matter volume, WMV）呈正相关。在PWH中观察到细胞因子与NP分数间的显著正相关，涉及IP-10/CXCL10、MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4、IL-15、IL-6和TNF-α。IL-10、IL-15、IL-8/CXCL8、IP-10/CXCL10、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）与CSF总tau蛋白（total tau）和神经丝轻链（neurofilament light, NfL）水平呈正相关。主成分分析（principal component analysis, PCA）揭示了PWH的离散亚群。人口统计学和合并症未显著影响PWH与PWoH之间的差异。
**Interpretation**：病毒学抑制的PWH的CSF中多种细胞因子的升高表达提示存在持续的免疫活动，支持中枢神经系统（central nervous system, CNS）储存库（reservoir）的存在。许多细胞因子与NP数据呈现有利关联，包括"促炎"细胞因子如IL-6和TNF-α以及多种趋化性细胞因子，而某些"抗炎"细胞因子如IL-10则与不利的神经退行性标志物呈正相关。研究人员认为，PWH的CNS中细胞因子的功能不同于外周，具有多效性（pleiotropic）和潜在保护作用，并随时间演变。

**研究背景与问题**

人类免疫缺陷病毒（HIV）主要感染CD4⁺淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞，导致获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome, AIDS）。尽管抗逆转录病毒治疗（antiretroviral therapy, ART）的广泛应用显著降低了HIV/AIDS的死亡率，但许多感染者仍持续带病生存。HIV在感染后迅速建立中枢神经系统（CNS）储存库，病毒RNA在感染后8天即可在脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中检测到。主要储存库细胞包括CD4⁺T淋巴细胞和单核细胞/小胶质细胞，星形胶质细胞亦可储存整合的前病毒。即使ART疗效显著，CNS储存库仍无法被根除，脑内病毒转录持续存在，可能促进认知功能障碍的发生。

目前关于HIV神经病理生理机制的研究提示，持续炎症、血脑屏障功能障碍、氧化应激、代谢改变、谷氨酸调节异常和兴奋性毒性可能参与其中。细胞因子作为炎症的关键介质，可能反映CNS中HIV持续存在的状态。然而，既往研究主要评估血液中的细胞因子和HIV标志物水平，少数针对CSF的研究多纳入病毒学未控制队列、存在显著神经系统合并症或缺乏额外临床信息进行相关分析的队列。因此，在病毒学抑制且病毒抑制时间较长的PWH中，CSF细胞因子表达模式如何？这些表达与神经影像学、神经心理学（neuropsychometric, NP）及神经退行性标志物之间有何关联？这些问题尚待阐明。

**研究人员开展的研究与意义**

研究人员依托ALLHANDS研究（ClinicalTrials.gov ID: NCT01875588；NIH临床中心），在82名病毒学抑制的PWH（136份CSF样本）和25名人口统计学匹配的PWoH（30份CSF样本）中开展纵向自然病史研究。参与者接受年度腰穿、MRI脑扫描和NP测试，使用磁珠检测法测量CSF中30种细胞因子浓度。

主要技术方法包括：采用多重磁珠检测法（multiplex magnetic bead assay）测量30种细胞因子浓度；通过3特斯拉脑MRI获取三维T1、三维FLAIR和二维质子密度/T2序列图像，并采用分类导数特征（Classification using Derivative-based Features, C-DEF）脑分割算法计算归一化灰质体积（normalized gray matter volume, nGMV）、归一化CSF体积（normalized CSF volume, nCSFV）、归一化白质体积（normalized white matter volume, nWMV）及白质高信号（white matter hyperintensity, WMH）负担；通过标准化NP测试组合评估多个认知域；采用Quanterix Simoa技术检测CSF中β淀粉样蛋白40（Aβ₄₀）、β淀粉样蛋白42（Aβ₄₂）、总tau（total tau）、磷酸化tau 181（p-tau₁₈₁）和神经丝轻链（neurofilament light, NfL）；运用主成分分析（principal component analysis, PCA）和随机森林（random forest, RF）分类进行数据降维和群体区分；使用Spearman相关分析评估细胞因子与临床及研究参数之间的横断面和纵向关联。

研究结论：病毒学抑制的PWH的CSF中多种细胞因子显著升高，提示CNS存在持续免疫活动，支持活动性CNS HIV储存库的存在。这一发现对于理解神经HIV的病理生理机制具有重要意义。

**研究结果**

参与者特征：通过比较PWH和PWoH的人口统计学和合并症数据，发现两组间年龄、性别、种族、民族、高血压、高胆固醇血症、糖尿病、药物滥用和受教育年限均无显著差异。PWH当前吸烟者比例较高，Beck抑郁量表（BDI）评分较高。

与HIV状态的相关性：通过Welch双尾t检验比较30种细胞因子的CSF浓度，发现13种在PWH中显著升高（p < 0.05），5种接近显著（p = 0.05–0.10），其中5种升高、1种降低。纵向分析显示4种细胞因子随时间增加，7种减少。

细胞因子与人口统计学、合并症及HIV参数的相关性：通过Spearman相关分析发现，在全部参与者中，Black参与者的IP-10/CXCL10和VEGF水平高于White参与者。在PWH中，不同ART方案、诊断时间和ART持续时间中，IL-15、MIP-1α/CCL3、VEGF和IL-12p40存在显著差异。

与神经心理学认知域的相关性：在PWH中，横断面分析显示NP认知域与细胞因子之间存在大量且主要为正相关的关联。PMS与TNF-α、IFN-α2、MIP-1β/CCL4、IL-1ra、IL-6、IL-12p70、IL-5和IFN-γ正相关；AWM与IL-8、MIP-1α/CCL3、MCP-1/CCL2、IL-5和VEGF正相关；VF与IL-6、IL-8/CXCL8、MCP-1/CCL2和IL-5正相关；EF与MCP-1/CCL2、IL-7和IL-6正相关；IPS与IL-6和MCP-1/CCL2正相关。总体T分数与IL-6、IL-5、MCP-1/CCL2和MIP-1α/CCL3正相关。

与MRI测量的相关性：在PWH中，7种细胞因子（EGF、IL-15、IL-6、IP-10/CXCL10、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3和TNF-α）与更大的WMH负担正相关。nWMV与eotaxin/CCL11、G-CSF、GM-CSF和IL-1ra正相关，与EGF和IP-10/CXCL10负相关。EGF与nCSFV正相关。

与神经退行性标志物的相关性：6种细胞因子（IL-15、IL-8/CXCL8、IP-10/CXCL10、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3和VEGF）与CSF中NfL和total tau均呈正相关。IL-10与total tau正相关。GM-CSF、IFN-α2和IL-12p40与NfL负相关。

主成分分析：PCA识别出3个聚类。RF分类在区分PWH和PWoH时达到73.44%准确率，IP-10/CXCL10、nGMV、MCP-1/CCL2、IL-12p40和EGF是区分PWH与PWoH最重要的特征。在区分PWH亚群时，RF分类达到98.00%准确率，IL-1ra、EGF、IFN-α2、IL-15和IL-6是区分cluster 1与cluster 2+3最重要的特征。

**讨论部分与结论**

讨论部分指出，几乎所有测量的细胞因子在PWH的CSF中浓度均高于PWoH，提供了CNS免疫激活增加的间接但有力的证据。这种差异并非由PWH人群血管合并症增加率驱动，强化了CNS中活动性HIV储存库的概念。在病毒学抑制超过十年的队列中，CNS区室的细胞因子表达模式可能已达到生物学稳态。值得注意的是，在CSF中检测到HIV（<100 copies/ml）的少数样本并未改变相对于PWoH的细胞因子表达模式，但大多数细胞因子（26/30）在PWH不可检测病毒载量者中高于有病毒blip者，研究人员提出三种可能的解释：病毒复制可能抑制正常CNS免疫反应；免疫反应耗竭可能使病毒得以产生；病毒复制被消除后病毒转录本和蛋白质积累可能更具免疫原性。

研究还发现，传统"促炎"细胞因子如IL-6和TNF-α与NP分数呈正相关，表明较高水平可能与较好认知结局相关。TNF-α具有多效性，通过TNFR1的信号传导具有促炎和促凋亡作用，而通过TNFR2的信号传导在CNS中促进神经元存活、神经发生、髓鞘形成、血脑屏障稳态和突触可塑性。IL-6在神经元和胶质细胞中具有神经营养功能，参与轴突再生。趋化细胞因子如MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4和IL-5也显示与NP数据的多种正相关关系。IP-10/CXCL10在PWH中高表达，与有利和不利的NP及MRI测量均相关，反映了其在CNS中的争议性作用。CSF total tau和NfL与6种细胞因子呈正相关，提示神经轴突损伤与免疫激活之间的关联。

研究结论部分强调：病毒学抑制的PWH的CSF中多种细胞因子的升高表达表明存在持续的免疫活动，支持CNS储存库的存在。许多细胞因子与NP数据呈现有利关联，包括"促炎"细胞因子如IL-6和TNF-α以及多种趋化性细胞因子，而某些"抗炎"细胞因子如IL-10与不利的神经退行性标志物呈正相关。研究人员认为，PWH的CNS中细胞因子的功能不同于外周，具有多效性和潜在保护作用，并随时间演变。这项研究是评估病毒学抑制PWH中CSF细胞因子表达的最大规模研究之一，为理解神经HIV的病理生理机制提供了新见解。