《Journal of Food Composition and Analysis》：Development and in-house validation of an element-specific PCR method for the detection of a modified pat (moPAT) gene in maize GMOs
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一种针对“修饰pat”（modified pat, moPAT）转基因（genetically modified, GM）筛选元件的新型实时PCR（real-time PCR）检测方法已成功完成内部验证。所有评估的性能参数均符合最低性能要求（minimum p
一种针对“修饰pat”（modified pat, moPAT）转基因（genetically modified, GM）筛选元件的新型实时PCR（real-time PCR）检测方法已成功完成内部验证。所有评估的性能参数均符合最低性能要求（minimum performance requirements）。经内部验证的检测方法有助于形成更高效的转基因生物（genetically modified organisms, GMO）筛选策略。
研究背景与目的：欧盟法规（EC）No. 1829/2003和（EC）No. 1830/2003要求对食品和饲料中的转基因生物（genetically modified organisms, GMOs；经基因工程改造的生物及其产品）进行上市后监测。EU授权的GM事件由2011年的31个增至2023年的53个，并在2026年达到62个，逐一检测每个GM事件效率低下，因此欧洲常规检测实验室采用筛查策略，以最少的筛查方法指示尽可能多的GM事件。随着新GMO出现，筛查策略需重新审查并调整。近期，若干新授权含草铵膦乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase, pat）基因的GMO无法被现有pat检测方法检出；EUginius数据库含61个带pat基因的单事件GMO，其中至少12个事件的pat基因不能被当前pat检测方法检出。moPAT是1997年Pioneer Hi-Bred Int申请专利的“单子叶植物优化”pat选择标记基因，其核苷酸序列改变可提高在玉米中的表达，现有pat实时定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）方法不能检测该序列。因此，研究人员开发并内部验证了针对moPAT的qPCR方法，可检测至少5个EU授权玉米GMO：DP202216、DP23211、DP51291、DP910521和DP915635，并与欧洲转基因实验室网络（European Network of GMO Laboratories, ENGL）的Advisory Group ‘Selection of Methods’合作完成方法开发和初步验证。
关键技术方法（≤250字）：样本为有证参考物质（certified reference materials, CRMs），来源为JRC Directorate F（Geel, Belgium）和AOCS（Illinois, United States）。从专利数据库和NCBI收集玉米moPAT序列，用BLASTn和Clustal Omega比对，以AlleleID设计引物和探针（5’端FAM?、3’端BHQ1?）。DNA经Maxwell? RSC 48及PureFood GMO and Authentication Kit提取，NanoDropOne和qPCR检查质量。qPCR在Bio-Rad CFX Opus 96/384进行，25 μl体系，含12.5 μl mastermix、400 nM引物、200 nM探针和5.0 μl 10 ng/μl DNA；条件为50 °C 2 min、95 °C 10 min、45个循环（95 °C 15 s、60 °C 1 min），双重复，CFX Maestro 2.3分析。用CRM评估特异性、检出限和概率检出，DP910521用于灵敏度；稳健性测试改变mastermix、引物/探针量、退火温度及96/384孔板。
研究结果：
3.1 In silico analysis of pat sequences（pat序列的计算机模拟分析）：通过比对所列GMO事件的moPAT编码区，未发现可检测所有moPAT序列的通用方法；油菜、大豆和甜菜的moPAT序列与除一个GM玉米品种外的所有GM玉米序列不同，因此研究人员决定开发专门针对GM玉米的单一moPAT检测方法，命名为QL-ELE-moPAT-F/moPAT-R。用EUginius和JRC GMO-MATRIX数据库进行计算机模拟分析，验证含pat的GMO不被moPAT方法检测；Primer-BLAST对NCBI核心核苷酸集合未发现除来自S. viridochromogenes的“常规”pat编码序列外的扩增产物；moPAT探针与常规pat序列有4个错配，预期不产生阳性qPCR信号；moPAT扩增子对专利序列的BLAST分析获得超过180个100%一致命中，提示未来使用这些载体的GM作物也可被检测。
3.2 Specificity（特异性）：通过CRM材料评估目标特异性，材料包括5个玉米moPAT目标、21个其他pat目标和7个无pat或moPAT目标。5个含moPAT的CRM材料DP202216、DP23211、DP51291、DP910521和DP915635均为阳性；不含玉米moPAT目标的CRM均为阴性，未观察到交叉反应。因此，moPAT方法具有高特异性。
3.3 Sensitivity（灵敏度）：以DP910521的CRM DNA稀释液确定moPAT目标的检出限（limit of detection, LOD）LOD
12，结果为每反应10拷贝，符合每反应<25拷贝的最低性能要求（Minimum Performance Requirements, MPR）。概率检出（probability of detection, POD）曲线显示，当PCR中存在9拷贝时POD为95%（LOD
95%）。
3.4 Robustness（稳健性）：尽管使用不同热循环仪和不同mastermix，并结合对初始方案的刻意改变，moPAT检测未受影响；在每孔30拷贝moPAT目标条件下，稳健性得到成功证明。
讨论与结论：讨论部分强调，当新GM事件上市时，应审查对元件和构建等筛查目标的检测能力，避免新GM事件在筛查中漏检。某些GMO植物物种中的密码子优化会使筛查复杂化；除草剂抗性基因中密码子优化也见于源自Agrobacterium tumefaciens CP4的CP4-epsps基因——一种广泛使用的赋予草甘膦耐受性的基因，其密码子优化变体可见于nCX-1玉米和EU授权MON87427玉米。moPAT检测方法可检测多个含无或少量已知其他GM元件的GM玉米品种，从而减少对每个事件分别进行事件特异性检测的需要；开发新的GM元件检测方法有助于在市场上出现越来越多EU（未）授权GMO时实现更高效常规GMO筛查。内部验证后，计划与EURL-GMFF和ENGL咨询组合作开展方法可转移性研究和实验室间验证。
结论部分译文：研究人员开发了一种检测修饰pat基因（moPAT）的新PCR方法，并成功用于定性检测；结果表明该方法具有令人满意的特异性、灵敏度和稳健性，符合定性检测推荐性能要求。研究指出，至少八个玉米GMO含有pat基因的修饰形式；当专用元素特异性检测方法不足以检测时，某些GMO植物物种中的密码子优化将使筛查复杂化。除草剂抗性基因中密码子优化也见于源自Agrobacterium tumefaciens CP4的CP4-epsps基因——一种广泛使用的赋予草甘膦耐受性的基因。这种密码子优化变体可见于nCX-1玉米和EU授权MON87427玉米。因此，当新GM事件上市时，需要审查检测某些筛查目标如元件和构建的能力，以避免新GM事件在筛查中未被检出。moPAT检测方法允许检测若干含无或少量已知其他GM元件的GM玉米品种，从而消除对每个事件分别进行事件特异性检测的需要。开发新的GM元件检测方法有助于在市场上出现越来越多EU（未）授权GMO时实现更高效常规GMO筛查。内部验证后，计划与EURL-GMFF和ENGL咨询组合作开展方法可转移性研究和实验室间验证。
