《Journal of Hazardous Materials Advances》：Association of Plasma Legacy and Emerging PFASs with HBV-Related Hepatocellular Carcinoma Risk: A Case-Control Study with Network Toxicology and Molecular Simulation Analyses
编辑推荐：
：
原发性肝癌（primary liver cancer, PLC）是全球第六大常见癌症和第三大癌症死因。在中国，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的主要病因
：
原发性肝癌（primary liver cancer, PLC）是全球第六大常见癌症和第三大癌症死因。在中国，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的主要病因。全氟和多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances, PFASs）因其环境持久性和广泛暴露而备受关注，但现有关于PFASs暴露与HCC风险关联的流行病学证据尚不一致，尤其缺乏对新兴替代物的研究。本研究开展了一项纳入390例HBV相关HCC（HBV-HCC）病例和390例乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性对照的病例对照研究，检测血浆中六种PFASs浓度，采用逻辑回归、线性回归、限制性立方样条（restricted cubic spline, RCS）、贝叶斯核机器回归（Bayesian kernel machine regression, BKMR）和加权分位数和（weighted quantile sum, WQS）回归评估单一及混合PFASs暴露与HCC风险及肝损伤标志物[丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）]水平的关联，并通过中介分析探索潜在机制。进一步整合网络毒理学、转录组验证（基于研究人员内部RNA测序数据及TCGA-LIHC数据集）和分子模拟（分子对接与100纳秒分子动力学模拟）识别候选分子靶点。结果显示，6:2氯化多氟醚磺酸盐（6:2 Cl-PFESA）在混合暴露模型中贡献权重最高，其第四分位浓度与HCC风险显著升高相关（OR=2.19, 95%CI=1.38-3.50），并与ALT和AST水平呈正相关。中介分析表明ALT和AST可能部分介导了6:2 Cl-PFESA与HCC的关联。网络毒理学鉴定出丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）和转化生长因子β1（TGFB1）为核心靶点，二者在肿瘤组织中均上调表达，分子模拟显示6:2 Cl-PFESA与这两种蛋白形成稳定复合物。研究结论认为，血浆PFASs（尤其是6:2 Cl-PFESA）暴露与HBV相关HCC风险及肝损伤标志物升高相关，MAPK3和TGFB1可能是潜在的分子靶点，但仍需前瞻性研究和功能实验加以验证。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
原发性肝癌（primary liver cancer, PLC）是全球第六大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，严重威胁人类健康。其中，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是最主要的病理类型，占PLC病例的75%至85%。在中国，超过84%的HCC患者合并乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染。近年来，环境污染物暴露与HCC发病风险的关系日益受到关注。全氟和多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances, PFASs）是一类人工合成的化学物质，因其碳-氟键的高稳定性而被广泛应用于日常用品和工业制造，但也导致其在环境介质、食物和人体生物样本中普遍检出。已有流行病学和毒理学证据将PFASs暴露与内分泌干扰、甲状腺功能改变、免疫调节异常、慢性肾脏病及多种癌症相关联。然而，目前关于PFASs暴露与HCC风险关联的流行病学证据尚不充分且结果不一致：部分研究发现全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate, PFOS）暴露与HCC风险升高有关，另一些研究则未观察到显著关联，甚至发现负相关。更重要的是，随着全氟辛酸（perfluorooctanoic acid, PFOA）和PFOS被列入《斯德哥尔摩公约》受控清单，其替代品如6:2氯化多氟醚磺酸盐（6:2 Cl-PFESA）等新兴PFASs的使用日益增加，但这些替代品的肝脏毒性及其与HCC的关系尚缺乏充分的人群研究证据。因此，亟需开展研究系统评估传统和新兴PFASs暴露与HBV相关HCC风险的关联，并探索潜在分子机制。
二、研究设计与主要结论
研究人员在广西壮族自治区开展了一项病例对照研究，于2019年5月至2023年8月期间，从广西医科大学附属肿瘤医院招募390例初诊HBV相关HCC病例，并从广西医科大学武鸣医院、柳州市工人医院和钦州市第一人民医院的肝癌筛查点招募390例HBsAg阳性对照。病例和对照组按年龄（±5岁）、性别和居住地区进行频数匹配。研究人员采集外周血分离血浆，检测六种PFASs（PFOA、GenX、NONA、PFOS、6:2 Cl-PFESA和8:2 Cl-PFESA）浓度，并收集吸烟状况、饮酒状况、体重指数（body mass index, BMI）和癌症家族史等信息作为协变量。研究主要结论如下：（1）血浆6:2 Cl-PFESA浓度在病例组中显著高于对照组，而PFOA和PFOS在两组间无显著差异；（2）6:2 Cl-PFESA暴露与HCC风险升高显著相关，其第四分位浓度相比第一分位浓度的比值比（odds ratio, OR）为2.19（95%置信区间：1.38-3.50），且呈现非线性剂量-反应关系（U形曲线）；（3）6:2 Cl-PFESA暴露与丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）水平升高显著相关；（4）混合暴露分析一致表明6:2 Cl-PFESA是PFASs混合物中与HCC、ALT和AST关联贡献最大的组分；（5）中介分析提示ALT和AST可能部分介导6:2 Cl-PFESA与HCC的关联，中介比例分别为58.0%和56.2%；（6）网络毒理学和转录组验证鉴定出丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）和转化生长因子β1（TGFB1）为潜在分子靶点，分子模拟表明6:2 Cl-PFESA与这两种蛋白可形成稳定复合物。该研究的科学意义在于：首次在较大样本的中国人群中系统评估了传统和新兴PFASs与HBV相关HCC风险的关联，识别出6:2 Cl-PFESA为最相关的PFAS化合物，并通过多学科整合方法提出了可能的分子机制假说，为环境污染物的肝癌风险评估提供了新的流行病学证据。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：（1）超高效液相色谱-高分辨四极杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF/MS）测定血浆PFASs浓度；（2）二元逻辑回归和线性回归分析单一PFAS暴露与HCC风险及肝损伤标志物水平的关联；（3）限制性立方样条（restricted cubic spline, RCS）评估非线性剂量-反应关系；（4）贝叶斯核机器回归（Bayesian kernel machine regression, BKMR）和加权分位数和（weighted quantile sum, WQS）回归评估混合PFASs暴露的联合效应；（5）中介分析评估ALT和AST在6:2 Cl-PFESA与HCC关联中的中介作用；（6）整合网络毒理学分析（利用CTD、PubChem、OMIM和GeneCards数据库预测靶基因，STRING数据库构建蛋白互作网络，Cytoscape软件cytoHubba插件识别核心基因）；（7）转录组验证（利用研究人员内部的103对HCC肿瘤及配对癌旁组织的RNA测序数据和TCGA-LIHC数据集的外部验证）；（8）分子对接（AutoDock Tools）和100纳秒分子动力学模拟（GROMACS 2025.2）评估6:2 Cl-PFESA与核心靶点的结合稳定性和动态行为。
四、研究结果
3.1 研究人群基本特征：病例组和对照组在年龄、性别、居住地区、吸烟状况和BMI方面均衡可比，但病例组中饮酒者比例较低（43.8% vs. 71.0%）且有癌症家族史者比例较高（26.9% vs. 9.0%）。病例组的ALT和AST中位水平显著高于对照组。
3.2 血浆PFASs分布特征：PFOA和PFOS在所有参与者中均可定量，6:2 Cl-PFESA的定量率为99.7%，而NONA和8:2 Cl-PFESA定量率低于13.8%，GenX浓度均低于检测限。PFOA浓度最高（中位数约8.2 ng/mL），其次为PFOS（约3.2 ng/mL），6:2 Cl-PFESA浓度最低但在病例组中显著高于对照组（0.54 vs. 0.40 ng/mL）。PFASs之间呈正相关，PFOS与6:2 Cl-PFESA相关性最强。
3.3 单一PFAS暴露与HCC风险的关联：调整协变量后，6:2 Cl-PFESA第四分位浓度与HCC风险显著升高相关（OR=2.19），且随四分位递增趋势显著。对数转换后的6:2 Cl-PFESA每增加10倍，HCC风险升高98%（OR=1.98）。RCS分析显示6:2 Cl-PFESA与HCC风险呈U形非线性关系，在对照组第75百分位浓度（0.63 ng/mL）以上风险随浓度升高而增加。PFOA和PFOS与HCC风险无显著关联。
3.4 单一PFAS暴露与肝损伤标志物水平的关联：6:2 Cl-PFESA四分位浓度与ALT和AST水平均呈正向趋势，对数转换浓度也与两者水平显著正相关。RCS分析显示6:2 Cl-PFESA与ALT呈线性关联，与AST呈非线性关联。PFOA和PFOS与ALT或AST无显著关联。
3.5 亚组分析：PFOA在非饮酒者中与HCC风险显著相关，且与饮酒状态存在交互作用。6:2 Cl-PFESA在多个亚组中均与HCC风险显著相关，仅与居住地区的交互作用显著。
3.6 ALT和AST在6:2 Cl-PFESA与HCC关联中的中介分析：中介分析显示ALT和AST的正向间接效应显著，中介比例分别约为58.0%和56.2%，直接效应为正但不显著。进一步分析表明，6:2 Cl-PFESA与ALT的正向关联在HBsAg阳性对照和HCC病例中均存在且效应大小相似。
3.7 混合PFASs暴露与HCC风险及肝损伤标志物水平的关联：WQS回归显示混合PFASs暴露与HCC风险、ALT和AST水平均呈正向关联，6:2 Cl-PFESA在各模型中贡献权重最大。BKMR模型显示混合PFASs暴露在第55至75百分位之间与HCC风险升高相关，在第25至75百分位之间与ALT和AST水平升高相关，且未观察到PFASs之间的明显交互作用。
3.8 整合网络毒理学与RNA-seq验证：网络毒理学鉴定出218个6:2 Cl-PFESA与HCC的共同靶基因，蛋白互作网络分析筛选出ALB、MAPK3、IL1B、TGFB1和FN1为前五位核心基因。研究人员内部RNA-seq数据和TCGA-LIHC数据集均显示MAPK3、TGFB1和FN1在肿瘤组织中显著上调，ALB和IL1B显著下调。GO富集分析涉及硒离子应答、细胞外空间和转化生长因子β受体结合等生物学过程。KEGG通路富集分析涉及HIF-1信号通路、PD-L1表达与PD-1检查点通路、TNF信号通路、癌症通路和病毒致癌等关键通路。
3.9 6:2 Cl-PFESA与MAPK3和TGFB1的分子对接与分子动力学模拟：分子对接显示6:2 Cl-PFESA与MAPK3的结合能为-8.8 kcal/mol，与TGFB1的结合能为-6.7 kcal/mol。2D相互作用图谱揭示了不同的结合模式，包括静电锁定、氢键和卤素键等相互作用。100纳秒分子动力学模拟显示两个复合体系均保持稳定的骨架均方根偏差（RMSD）、回转半径（Rg）、均方根波动（RMSF）、溶剂可及表面积（SASA）和氢键数目，表明6:2 Cl-PFESA与两种蛋白在模拟条件下可形成稳定复合物。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究中6:2 Cl-PFESA与HCC的关联最为一致，这与该化合物具有较高的生物蓄积潜力和肝细胞毒性潜力的报道相符。观察到的U形剂量-反应关系可能反映了低剂量暴露激活补偿性防御或修复机制而高剂量暴露使保护机制失活的毒物兴奋效应，但该阈值不应被解释为因果性或临床确定的健康不良效应界值。中介分析虽提示ALT和AST可能部分介导6:2 Cl-PFESA与HCC的关联，但由于PFAS浓度、肝损伤标志物和HCC状态同时评估，无法建立时间或因果路径。网络毒理学和分子模拟结果将MAPK3相关的增殖信号和TGFB1相关的纤维化重塑列为需进一步研究的过程，但组织表达差异不能确定是对6:2 Cl-PFESA的响应，分子模拟也无法判断预测的相互作用是增强还是抑制蛋白质活性。对于传统PFASs，PFOA在非饮酒者亚组中与HCC风险相关，但亚组分析属探索性发现；PFOS在本研究中未观察到显著关联，可能与研究设计、样本量和暴露分布的差异有关。研究优势包括频率匹配的病例对照设计、同时评估传统和新兴PFASs、采用混合暴露分析和中介分析等多统计方法、以及整合网络毒理学和分子模拟的多学科验证。局限性包括：对照为非肝硬化对照而非按肝纤维化或肝硬化状态选择或匹配的对照，缺乏标准化FibroScan测量、可靠的肝硬化状态、HBV DNA水平和肾功能标志物；病例血浆样本在初诊时采集，缺乏诊断前PFAS测量，无法排除反向因果关系；PFAS浓度、ALT/AST和疾病状态同时评估，中介分析无法建立时间因果路径；所有参与者来自广西，样本量不足以进行稳健的亚组分析；未同时评估其他潜在相关环境污染物；预测的分子相互作用需功能实验验证。
研究结论部分：综上所述，本研究结果表明，单一和混合PFASs暴露（尤其是6:2 Cl-PFESA）与HBsAg阳性参与者的HBV相关HCC风险及肝损伤标志物升高存在关联。ALT和AST可能部分介导了6:2 Cl-PFESA暴露与HCC之间的关联。探索性转录组和计算分析进一步强调了MAPK3和TGFB1为候选靶点，可能与增殖信号传导和纤维化重塑有关。需要纳入诊断前PFAS测量和可比肝纤维化评估的前瞻性研究，以及实验研究，以阐明时间关系和潜在生物学机制。
