白细胞相关RNA滞留对基于血小板RNA的癌症检测的影响

《Molecular Oncology》：The impact of leukocyte-associated RNA retention on platelet RNA-based cancer detection

血小板RNA分析是一种前景广阔的液体活检方法，能够以微创方式提供对全身性疾病（如癌症）的深入见解。然而，白细胞相关RNA滞留对血小板转录组特征的影响尚不明确。本研究首次全面评估了白细胞相关RNA滞留如何影响血小板RNA测序及基于机器学习（machine learning，ML）的癌症检测。研究人员利用目前最大的公开血小板转录组数据集（2351个人类RNA样本）以及来自29名供体的单细胞/单血小板RNA测序数据，通过一个新型的132基因白细胞标志物组合，在匹配的样本组（低滞留组与高滞留组）中定量评估了白细胞相关RNA滞留。研究人员使用10种ML算法进行二元分类（癌症与健康）评估诊断意义，并检查了白细胞来源转录本的贡献。有趣的是，在高滞留样本上训练的模型通常表现出略微更优的性能，提示白细胞信号具有补充诊断价值。重要的是，事后校正采用去除不需要变异（remove unwanted variation，RUV）和线性建模方法可有效减轻滞留效应。然而，将白细胞相关RNA滞留评分加入全队列分类器后，癌症检测的曲线下面积（area under the curve，AUC）变化极小（从0.9247到0.9249）。因此，该信号是否应被校正、重新校准或报告，应取决于研究问题，而非假定常规去除。

论文解读：白细胞相关RNA滞留对血小板RNA癌症检测的影响

一、研究背景与科学问题

液体活检作为一种微创检测手段，能够实时、可重复地检测、表征和监测多种疾病，近年来受到广泛关注。血小板因其能够动态反映宿主对病理过程、治疗干预及生理变化的应答，成为液体活检中的重要分析对象。血小板虽为无核细胞，但保留了多样且功能相关的RNA谱系，包括约9500个蛋白编码基因及多种非编码RNA。然而，血小板分离方法对最终RNA产量和组成具有显著影响，即使极少量其他血细胞类型的残留也可能严重干扰血小板样本的分析，从而影响液体活检转录组图谱的解读。

既往研究（如STRIDE研究）已表明，与使用抗CD45磁珠或PALL?过滤器进行白细胞去除相比，仅通过洗涤血小板的方法会导致白细胞特异性基因的相对表达升高。由于目前大多数公开的血小板RNA测序数据集——包括包含2351个样本的大型泛癌数据集——均采用基于离心的洗涤血小板方案，因此白细胞相关RNA滞留可能对基于血小板RNA的癌症检测模型产生潜在混杂效应。然而，这一影响的程度及其对机器学习分类器性能的干扰尚未被系统评估。

基于此，研究人员提出了五个核心科学问题：（1）如何在计算机上估计血小板RNA测序中的白细胞相关RNA滞留；（2）白细胞相关RNA滞留对血小板RNA谱引入多大程度的转录噪声；（3）该滞留主要由患者间的生物学差异驱动还是由样本处理过程中的技术因素驱动；（4）该滞留如何影响基于血小板转录组数据训练的ML模型性能；（5）能否在已测序数据集中追溯性减轻该滞留效应。

二、研究设计与技术方法

研究人员使用了最大的公开血小板RNA测序数据集（GEO: GSE183635），包含2351个样本，涵盖健康供体及18种癌症类型。同时纳入了来自29名供体（10例乳腺癌患者、12例高级别卵巢癌患者、4例非恶性疾病患者及3例健康供体）的单细胞RNA测序数据。主要技术方法包括：利用单细胞RNA测序数据通过UCell细胞类型分类鉴定白细胞标志基因，构建132基因白细胞相关RNA滞留评分；采用随机森林回归（RFR）模型分析滞留的决定因素；使用Caliński–Harabasz指数进行阈值聚类分组；应用MatchIt进行样本匹配构建低/高滞留平衡数据集；采用10种ML算法（逻辑回归、支持向量机（SVM）、K近邻（KNN）、随机森林、平衡随机森林、极端随机树、XGBoost、LightGBM、梯度提升及AdaBoost）进行癌症二元分类；应用去除不需要变异（RUV）和线性校正两种事后校正方法。

三、主要研究结果

3.1 血小板RNA样本中白细胞相关RNA滞留的概览

研究人员通过单细胞分析鉴定出138个候选白细胞相关标志基因，经严格跨资源比对后保留132个基因用于最终的白细胞相关RNA滞留评分。基于Caliński–Harabasz指数将样本分为低、中、高滞留三组，并构建了低/高滞留匹配数据集（754个样本，各377例）。

3.2 白细胞相关RNA滞留水平的估计

132基因评分与仅含PTPRC的评分高度一致（Pearson r=0.831，P<0.001；Spearman ρ=0.913，P<0.001），与109基因非核糖体敏感性评分也高度一致（Pearson r=0.967，P<0.001；Spearman ρ=0.990，P<0.001），表明滞留轴在不同标志物定义下具有稳健性。

3.3 白细胞相关RNA滞留对血小板泛癌数据的影响

主成分分析（PCA）显示，白细胞相关RNA滞留评分沿第一主成分呈现明显梯度，低滞留样本位于左侧，高滞留样本位于右侧，表明该滞留对数据聚类具有主导性影响。相比之下，癌症类型、癌症分期和采血机构未显示明显聚类模式。

3.4 白细胞相关RNA滞留决定因素分析

随机森林回归模型解释了90%的滞留评分方差。特征重要性分析显示：测序文库大小贡献0.38，采血机构贡献0.33，年龄贡献0.20，癌症分期贡献0.06，性别贡献0.03，癌症与否贡献0.01。技术因素模型（R2=0.87）显著优于生物学因素模型（R2=0.22），表明技术因素对滞留的影响远大于生物学因素。

3.5 基于阈值的白细胞相关RNA滞留聚类

低/中滞留阈值为11600，中/高滞留阈值为33100，评分范围为2529.34至90667.13。聚类获得Caliński–Harabasz指数661.90，低滞留样本1156例，中滞留639例，高滞留556例，约24%的样本呈现高滞留。

3.6 样本匹配

通过匹配构建了754个样本的数据集（377例低滞留和377例高滞留），在年龄、性别、癌症分期、癌症类型方面实现平衡。乳腺癌、肾细胞癌和肝细胞癌因仅含低滞留样本而被排除，最终涵盖15种癌症类型及健康供体。

3.7 匹配低/高分析及机器学习实验

在低/高滞留测试子集评估中，逻辑回归在低滞留测试集AUC为0.89±0.02，高滞留测试集为0.91±0.01（P=0.0002）；SVM分别为0.91±0.01和0.90±0.02（P=0.0998）；KNN分别为0.82±0.06和0.78±0.03（P=0.0067）。仅逻辑回归、平衡随机森林和KNN表现出统计学显著差异。在分别用低/高滞留训练集训练并评估完整测试集时，所有模型在高滞留训练集上表现相当或更优，但仅SVM（0.84 vs 0.76，P=0.0003）、LightGBM（0.79 vs 0.74，P=0.0006）和XGBoost（0.74 vs 0.71，P=0.0085）达到统计学显著。

3.8 白细胞相关RNA滞留校正

RUV校正后Caliński–Harabasz指数从661.90降至12.20，基于文库大小的RUV校正降至5.78，线性校正降至99.49。在匹配数据集上，RUV校正后低/高滞留测试集AUC仍存在显著差异（0.90±0.02 vs 0.92±0.01，P=0.001）；线性校正后两组AUC均为0.88±0.02（P=0.792），无显著差异。

3.9 全队列分类器敏感性分析

将132基因滞留评分作为连续协变量加入全队列（2351样本）逻辑回归癌症分类模型后，AUC仅从0.9247微调至0.9249。滞留评分系数为-0.000065，在5347个特征中排名第5336位。

四、讨论与结论

讨论部分指出，白细胞相关RNA滞留主要由技术因素驱动，而非生物学因素。尽管滞留信号在表达空间中显著可见，但与癌症检测信号的重叠有限。RUV校正虽能大幅消除滞留驱动的聚类结构，但可能过度去除生物学相关信息；线性校正则在减少技术偏差和保持诊断准确性之间取得更佳平衡。校正策略应根据具体分析目标选择，而非不加区分地应用。

结论部分确认，血小板RNA是癌症分类信号的主要来源，白细胞相关RNA滞留对整体模型性能影响有限。然而，滞留白细胞来源的转录本可能提供补充信息，在某些情境下可增强分类准确性。对于以生物学机制研究为导向的探索，高样本纯度至关重要，需采用严格分离方法（如过滤或抗CD45磁珠选择）及基于滞留评分的质量控制；对于诊断应用，则可谨慎纳入白细胞来源信号。标准化方案和精心选择的校正方法将是维持血小板液体活检研究中信息保留与可解释性平衡的关键。