美国展览猪-人界面甲型流感病毒主动监测：青年参展者中和抗体与猪源病毒遗传多样性

《Zoonoses and Public Health》：Influenza A Virus at the Exhibition Swine-Human Interface in the USA

　　

引言：在美国，人畜共患甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）传播频繁发生于在农业竞赛中展示猪的青年中，构成持续的大流行风险；然而，该高风险人群缺乏主动监测。
方法：为弥补这一空白，研究人员于2019—2021年在9场猪展览中招募711名青年参与者，并采集700份鼻拭子和400份血清样本。研究人员评估了入组者针对世界卫生组织（World Health Organization, WHO）推荐的8种甲型流感H1和H3变异候选疫苗病毒（candidate vaccine viruses, CVVs）的中和抗体滴度。
结果：研究人员发现，最高中和滴度未必与同期展览猪中最流行的特定病毒相关。该队列针对Cluster IV-A（clade 3.1990.4.a）CVV的几何平均滴度较低；基于同期猪IAV监测（n=430条基因组序列），研究人员确定该CVV是2020—2021年展览猪中流行的最主要血凝素（hemagglutinin, HA）谱系。
结论：该高强度接触家畜的高风险人群中和抗体水平相对较低，提示需要持续开展外展和监测。持续监测猪和人的IAV可为病毒风险评估提供信息，并为候选疫苗病毒选择提供考虑。

研究背景与目的：甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）每年在人群中引起呼吸道疾病，并在动物储存宿主中维持独立病毒多样性，可向人群引入新IAV并带来大流行风险。美国农业竞赛中展示猪的青年常发生人畜共患IAV传播，是持续大流行风险人群，但该高风险人群缺乏主动监测。展览猪生物安全相对较低，全国展览网络互联，可使猪IAV在夏季县集市间快速传播；猪亚临床感染难以检测，可在县集市猪群扩散并溢出至人。既往变异流感病毒（variant influenza viruses）监测多为被动，病例可能被低估，且不能提供参展者针对猪源IAV的血清学保护信息。一般公众对部分猪源IAV谱系缺乏抗体，儿童尤易缺乏交叉反应抗体；全国jackpot展览青年经常跨州接触多猪，是猪-人界面重要监测人群。为此，研究人员在2019—2021年对全国jackpot展览青年参展者开展横断面主动监测，同时监测展览猪，比较人与猪IAV遗传多样性和暴露，并评估针对WHO推荐CVVs的中和抗体。研究结论为：最高中和滴度未必对应同期猪中最流行病毒；对2020—2021年展览猪中最流行HA谱系Cluster IV-A（clade 3.1990.4.a）CVV的几何平均滴度（geometric mean titers, GMTs）低。其意义在于：高暴露人群中和抗体相对低，需持续外展和监测；猪与人持续监测可支持风险评估和CVV选择。

关键技术方法：2019—2021年从美国Georgia、Indiana、Kentucky、Ohio、Oklahoma五州九场jackpot猪展览招募5—21岁、每日或近每日接触猪的青年（711人；700份鼻拭子、400份血清），并采集展览猪样本（430株测序）。以实时逆转录PCR（real-time reverse transcription PCR, rRT-PCR）筛查IAV基质基因；阳性人鼻拭子经Madin Darby Canine Kidney（MDCK）细胞分离，对Ct≤32猪样本及人分离株行多片段PCR和Illumina MiSeq测序；用octoFLU、Nexclade分配HA谱系，IQTree2最大似然法构建系统发育树。血清经RDE II处理，以96孔微量中和试验测8种WHO CVVs中和滴度；用Kruskal-Wallis、Dunn、Benjamini-Hochberg和普通最小二乘（ordinary least squares, OLS）回归；SARS-CoV-2 IgG用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）。

研究结果：
3.1 Enrollment of Youth Exhibitors：通过2019—2021年九场猪展览横断面招募711名独特青年，采集700份鼻拭子和400份血清；总样本平均13.18岁，血清提交者13.71岁；参与者来自20州，主要来自美国中西部和南部，65%报告曾接种流感疫苗。
3.2 IAVs Circulating in Exhibition Swine, 2019–2021：为确定人可暴露的猪IAV遗传多样性，对2019—2021年美国县集市和jackpot展览猪430株IAV测序，其中44株来自人监测同场猪；同场9场中8场采集2798份猪样本，111份rRT-PCR阳性。结果显示4个H1和3个H3谱系共循环并优势轮换：2019年H1多见，尤其delta-2（1B.2.1）；2020—2021年H3 Cluster IV（3.1990.4.a）更常检出；其他包括H1 alpha（1A.1.1）、H1 pandemic（1A.3.3.2）、H1 gamma（1A.3.3.3）、H3-2010（3.2010.1）、H3-2016（3.2010.2）；并鉴定2个N1、3个N2和3个内部基因谱系，共11个重组基因型。结论是青年参展者可能暴露于广泛IAV多样性。
3.3 Swine-To-Human Transmission：2019—2021年CDC测序13例变异IAV，包括11株H1^v和2株H3^v；部分如A/Indiana/01/2021与本研究展览猪病毒系统发育聚集，符合展览猪场人畜共患传播；尽管H1 delta-2在猪中最广，更多人变异病例由其他谱系如H1N1^pdm09（1A.3.3.2）导致。700份人鼻拭子中1份IAV rRT-PCR阳性，来自Georgia 17岁未接种者（2021年1月）；分离A/Georgia/HU-TOSU0061/2021，为非重组H1N1^pdm09；与2917株美国人/猪H1N1^pdm09系统发育分析显示其非猪源，而与同期美国人H1N1^pdm09聚集，提示更可能人传人获得。
3.4 Human Serology：用8种CVVs微量中和试验检测血清。对两种H3 3.2010.1病毒GMT最高（416和110）；与居住州无显著关联，但曾接种流感疫苗者滴度显著更高，可能与人季节性H3N2交叉反应。对H3 Cluster IV（3.1990.4.a）CVV GMT最低（35.9），州间变异；控制既往疫苗和年龄后，Plains和Midwest参展者对A/Minnesota/11/2010（H3N2）Log2滴度显著高于South。

讨论总结：讨论指出，研究人员十多年来对猪开展主动监测，本研究首次加入人主动监测，采集血清和鼻拭子直接捕获人-动物界面，直接比较人猪IAV多样性和暴露。研究支持每年多种IAV在展览猪循环，难以预测优势clade和高风险。2019 H1-delta2高流行与前一年一致，并与2018夏人H1变异病例相关；2021 H3 3.2010.1曾于2016年引起集市相关变异暴发，2016—2018年最常见H3；参展者高滴度与该clade既往高流行一致，但既往人季节性IAV暴露也可能贡献，85%血清参展者≥10岁，可能暴露于后来传猪并建立3.2010.1的人季节性前体病毒。3.1990.4.a在2019增加未对应报告变异暴发，尽管低中和滴度；参展者均未老到有1990年代人源祖先季节性暴露。2012年3.1990.4变异导致最大报告变异IAV暴发，主要在中西部青年参展者、Plains少；本研究中Plains参展者对该CVV滴度最高，与历史报告地理重点不一致，未来可评估该亚人群漏报。人监测试点证明可从风险农村青年获取样本监测人畜共患风险；多年The Ohio State University Swientist program外展建立信任。方法学挑战包括：猪源变异与人季节性株交叉反应（美国猪IAV多为人源；H3-2016近十年人传猪），区分近期猪株暴露与童年相似人株暴露需改进统计及更多人和猪株；IAV潜伏期数天，展览现场PCR多不可检出，需回家自采邮寄，较不可靠且后勤难。入组主要大型全国jackpot（通常500—1500猪），参展者饲养和旅行频率强度异质；许多南部参展者可能不去中西部展览；早期COVID-19公共卫生限制地区不同，但2020仍聚集，未发现2021前农业青年SARS-CoV-2 substantial社区传播血清学证据。无纵向血清不能直接由血清学推断猪源IAV感染；jackpot参展者可能也参加县集市，但未必代表全部风险人群。未来检测应虑潜伏期并在猪暴露后2—3天采样，可针对更常报告人畜共患传播的农业集市；应密切监测3.1990.4.a，考虑其既往青年参展者暴发史、人-动物界面低中和保护及再出现；2024年WHO推荐A/swine/Iowa/23TOSU0850/2023（3.1990.4.a）作为新H3N2^v CVV制备，应用于美国猪-人界面人参展者风险评估。

研究结论（摘要）译文：该高强度接触家畜的高风险人群中和抗体水平相对较低，提示需要持续开展外展和监测。持续监测猪和人的IAV可为病毒风险评估提供信息，并为候选疫苗病毒选择提供考虑。