《Journal of Oral Biosciences》：Nanoencapsulation of mānuka oil and β-triketones for antimicrobial delivery in oral wounds
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目的：评估将mānuka油（mānuka oil）及β-三酮类化合物（β-triketones）包封于壳聚糖纳米粒（chitosan nanoparticles, CNPs）中，作为口腔创面控制释放抗菌递送系统的可行性。方法：采用三聚磷酸钠（sodium tr
目的：评估将mānuka油（mānuka oil）及β-三酮类化合物（β-triketones）包封于壳聚糖纳米粒（chitosan nanoparticles, CNPs）中，作为口腔创面控制释放抗菌递送系统的可行性。方法：采用三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate, TPP）离子凝胶法制备未载药CNPs、载mānuka油CNPs及载β-三酮CNPs，优化壳聚糖:TPP质量比（5:1、4:1、3:1）及壳聚糖和TPP的pH；以动态光散射（dynamic light scattering, DLS）测定粒径、多分散指数（polydispersity index, PDI）和Zeta电位，以扫描电镜（scanning electron microscopy, SEM）和光镜观察形态，以280 nm分光光度法测定包封率（encapsulation efficiency, EE）及体外释放；以最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）评价对E. faecalis V583、S. mutans UA159、P. gingivalis ATCC33277和S. aureus ATCC6538的抗菌活性；以PrestoBlue法和结晶紫染色评价人间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）代谢活性。结果：最优配方为壳聚糖:TPP 5:1、壳聚糖pH 5.5、TPP pH 9；载mānuka油和载β-三酮CNPs的包封率分别为89.2%和89.5%，粒径分别为337 nm和288 nm，Zeta电位分别为+27 mV和+28 mV；体外释放表现为初期突释并持续至14天，β-三酮CNPs的高释放维持3天，长于mānuka油CNPs的1天；β-三酮CNPs的MIC总体优于mānuka油CNPs；MSCs代谢活性呈浓度依赖性双相变化，冻干保护剂海藻糖（trehalose）未显示明显影响。结论：载mānuka油及β-三酮的CNPs是具前景的口腔创面抗菌递送系统，可进一步整合入水凝胶、膜、移植材料或晶片等生物工程产品。
论文主体内容解读
研究背景：天然产物长期作为活性成分来源；抗生素耐药率上升使天然抗菌化合物受到更多关注，且天然化合物被认为较合成替代物对人细胞细胞毒性更低。mānuka（Leptospermum scoparium）为桃金娘科植物，是新西兰和澳大利亚原生灌木；Māori称其为taonga，并有作为传统药物和食物的应用历史。其叶煎剂用于退热和治疗感冒，树皮制剂用作镇静剂，mānuka油提取物用于治疗腹泻、感冒和炎症。mānuka油（mānuka oil）的抗菌活性归因于flavesone、leptospermone和iso-leptospermone等β-三酮类化合物（β-triketones）。现有少量含mānuka油制剂包括乳剂、纳米乳和微囊化漱口水，显示较单用油更好的抗菌和抗真菌活性，但不能避免从靶组织被立即冲走；且尚无将β-三酮单独纳入药物制剂的尝试。纯化β-三酮可达99%纯度，具有抗菌活性高3倍、去除多种未知成分从而简化产品重现性和安全性的优势。壳聚糖（chitosan）为天然氨基多糖，具生物相容性、生物降解性、黏膜黏附性和自身抗菌性；CNPs（chitosan nanoparticles，壳聚糖纳米粒）是药物递送载体。TPP（sodium tripolyphosphate，三聚磷酸钠）离子凝胶法较简单、避免有机溶剂、低温进行，可包封不稳定分子。因此，研究人员旨在研究将mānuka油和β-三酮包封于CNPs，以控制口腔创面释放。
研究人员制备未载药、载mānuka油和载β-三酮CNPs，优化离子凝胶参数并评价理化性质、体外释放、对四种口腔相关菌的抗菌活性及人MSCs（mesenchymal stem cells，间充质干细胞）代谢活性。结论为最优配方是壳聚糖:TPP 5:1、壳聚糖pH 5.5、TPP pH 9；载药CNPs包封率高、释放可持续、β-三酮CNPs抗菌活性更优，MSCs呈浓度依赖双相反应，海藻糖无明显影响。该研究为口腔创面抗菌递送提供可整合入水凝胶、膜、移植材料或晶片的纳米系统。
关键技术方法：采用TPP离子凝胶法制备CNPs，比较壳聚糖:TPP质量比5:1、4:1、3:1及壳聚糖/TPP pH；以DLS测粒径、PDI和Zeta电位，SEM与光镜观察形态；280 nm分光光度法测EE及磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）中14 d释放；以MIC/MBC评价E. faecalis V583、S. mutans UA159、P. gingivalis ATCC33277、S. aureus ATCC6538；以PrestoBlue和结晶紫评估人MSCs代谢活性，并以海藻糖对照排除冻干保护剂影响。原文未注明MSCs来源，未涉及临床样本队列。
3.1 纳米粒的制备（Production of nanoparticles）：通过气相色谱（gas chromatography, GC）分析，mānuka油提取物总β-三酮含量为29.2%，β-三酮提取物为99.7%。通过比较不同壳聚糖:TPP质量比及pH，DLS显示样品4、16、28（5:1、壳聚糖pH 5.5、TPP pH 9）PDI最低（0.654、0.471、0.379），呈单峰；光镜显示聚集少、粒径分布更均匀；SEM见<400 nm球体。选定配方粒径分别为327、337、288 nm，Zeta电位分别为+23、+27、+28 mV，冻干产量分别为266、338、370 mg，mānuka油和β-三酮包封率分别为89.2%和89.5%。结论：5:1、壳聚糖pH 5.5、TPP pH 9为优选配方。
3.2 体外释放（In vitro release）：通过PBS 37°C 14天释放和280 nm测定，冻干CNPs重悬后立即突释，1天后mānuka油约5天、β-三酮约7天中等释放，之后低释放至14天；β-三酮CNPs高释放维持3天，mānuka油CNPs为1天。结论：CNPs可实现mānuka油和β-三酮的持续释放，β-三酮释放更持久。
3.3 抗菌活性（Antimicrobial activity）：通过MIC/MBC测定，未载药CNPs除E. faecalis MIC为40 mg/ml外，MIC/MBC均>40 mg/ml；β-三酮CNPs的MIC总体优于mānuka油CNPs。E. faecalis MIC：mānuka油6.66、β-三酮0.62 mg/ml，MBC均>40；S. mutans MIC 20 vs 10、MBC >40 vs 40；S. aureus MIC 20 vs 5、MBC 20 vs 20；P. gingivalis MIC 20 vs 5、MBC 40 vs 10。结论：载β-三酮CNPs对受试菌抗菌活性更强，但不同菌种MIC/MBC有差异。
3.4 人MSCs代谢活性（Metabolic activity of human mesenchymal stem cells）：通过PrestoBlue和结晶紫染色，1.56和3.125 mg/ml时三组代谢活性高于对照；12.5和25 mg/ml下降；50–100 mg/ml回升，呈双相剂量反应；72 h高浓度细胞呈纺锤形和长突起。补充海藻糖至预期100 mg/ml含量时，12.5 mg/ml纳米粒组代谢活性仍低于对照20%，海藻糖无明显影响。结论：CNPs对MSCs代谢活性呈浓度依赖双相效应，载药未显著改变该趋势。
讨论部分总结：天然抗菌物疏水、易挥发，递送需维持生物活性和驻留；CNPs具黏膜黏附、包封和可调释放优势。离子凝胶所得粒径和分布受pH、分子量及壳聚糖:TPP比影响；5:1时粒径更小、聚集少，壳聚糖pH 5.5改善PDI，TPP pH 5.5+3:1虽PDI可比但粒径大且聚集。PDI与已有精油壳聚糖纳米粒报道相近；Zeta电位+23至+28 mV按文中判据接近短期稳定性范围。海藻糖作为冻干保护剂不影响抗菌和MSC代谢。释放可持续近一周，β-三酮高释放更久，可进一步整合入生物工程产品。菌种覆盖革兰阳性/阴性、需氧/厌氧；β-三酮CNPs活性更高；E. faecalis MIC低而MBC高可能与其对细胞壁靶向药物的内在耐受有关。临床负载需结合治疗方式和生物膜挑战确认；40 mg/ml载药纳米粒对应0.336%（v/v）活性物。壳聚糖单独对E. faecalis MIC为40。MSCs结果呈双相，较高浓度部分恢复并非海藻糖所致，可能与纳米粒相互作用或检测方法有关；壳聚糖可调节Wnt/β-catenin、Notch和HIF-1α信号，但需机制研究。体外模型不能完全反映体内剂量、驻留、黏附、释放、机械力和唾液流影响；研究人员正在研究凝胶和基质载体。
研究结论：将mānuka油、尤其是β-三酮类化合物包封于CNPs，可提供新型抗菌系统，有望整合入水凝胶、膜、移植材料或晶片，以制备用于口腔的生物工程产品。
