靶向USP25–SIRT1相互作用的新型多肽激活SIRT1去乙酰化酶活性并抑制细胞衰老

《Aging Cell》：A Novel Peptide Targeting the USP25–SIRT1 Interaction Activates SIRT1 to Suppress Cell Senescence

　　

去乙酰化酶SIRT1是细胞衰老的关键调控因子，衰老细胞的过度积累可进一步驱动机体衰老的发生。SIRT1活性受到翻译后修饰的严格调控，包括泛素化。虽然泛素化已被充分证明可调控SIRT1蛋白稳定性，但SIRT1活性精确的调控通路仍不清楚。本研究鉴定出去泛素化酶（Deubiquitinase, DUB）USP25是细胞衰老的核心调控因子。具体而言，USP25缺陷小鼠可减轻年龄相关表型并改善整体生理功能。机制上，USP25直接与SIRT1相互作用，并通过K63连接的多聚泛素化介导SIRT1去泛素化，特异性靶向SIRT1赖氨酸残基K506和K513，最终抑制SIRT1去乙酰化酶活性。SIRT1去乙酰化酶活性降低反而增加P53或PGC1α的乙酰化，进一步增强下游靶基因的转录激活，从而加速细胞衰老。此外，研究人员开发了一种细胞穿透肽（Cell-Penetrating Peptide, CPP）pSirt1-4，可高效破坏USP25–SIRT1相互作用，增加SIRT1去乙酰化酶活性并抑制细胞衰老。综上所述，研究结果确立USP25作为衰老关键调控因子的地位，并凸显USP25–SIRT1轴作为治疗衰老相关疾病的潜在治疗靶点。

细胞衰老是一种调控生理功能（如胚胎发育和伤口愈合）的复杂生物学过程，同时促进衰老、疾病和代谢紊乱的发生。衰老细胞具有增大扁平形态、细胞器异常、不可逆生长停滞及衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）等特征，SA-β-gal、P16和P21等生物标志物用于鉴定衰老。SIRT1是NAD⁺依赖性去乙酰化酶，作为衰老核心调控因子，通过调节P53、PGC1α和FOXO等关键靶点、增加基因组稳定性、促进代谢健康来对抗细胞衰老。目前多种SIRT1激活策略已见报道，包括直接激活（如STACs化合物SRT1720）或间接通过增加NAD⁺水平（如前体NMN和NR）或抑制负调控因子。然而，多数SIRT1激活剂仍处于临床前或早期临床试验阶段，最佳干预窗口和剂量尚不明确，长期安全性和疗效有待充分验证。蛋白质泛素化是可逆的动态翻译后修饰，调控蛋白质降解、相互作用及功能。去泛素化酶（Deubiquitinase, DUB）通过去除泛素链调节底物蛋白稳定性和功能，在衰老相关疾病中发挥重要作用。当细胞进入衰老时，蛋白质更新减慢，泛素化蛋白积累导致细胞功能障碍。USP25作为去泛素化酶，在炎症、免疫和癌症中发挥关键作用，但其在细胞衰老和机体衰老中的效应及机制尚不清楚，这正是本研究开展的出发点。

研究人员发现USP25是衰老相关因子，Usp25^?/?小鼠寿命延长、运动能力改善、衰老表型减轻。机制研究表明，USP25直接与SIRT1相互作用，通过K63连接的多聚泛素化介导SIRT1去泛素化，靶向K506和K513赖氨酸残基，抑制SIRT1去乙酰化酶活性，导致P53和PGC1α乙酰化增加，加速细胞衰老。研究人员进一步开发了细胞穿透肽pSirt1-4，通过竞争性破坏USP25–SIRT1相互作用激活SIRT1，有效抑制细胞衰老并改善衰老相关表型，为衰老相关疾病的精准治疗提供了新策略。

研究人员主要运用以下关键技术方法：免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation, Co-IP）验证USP25与SIRT1的直接相互作用；质谱分析（IP-MS/MS）鉴定互作蛋白及SIRT1泛素化位点；泛素化检测（Ubiquitination Assay）分析K63/K48连接的多聚泛素链；SIRT1去乙酰化酶活性测定（Deacetylase Activity Assay）定量分析酶活性变化；SA-β-gal染色检测细胞衰老水平；RNA测序（RNA-seq）结合基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）解析转录组变化；表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）筛选靶向USP25–SIRT1相互作用界面的多肽；分子截断映射确定SIRT1与USP25结合的功能结构域。研究样本来源于C57/BL6背景的Usp25^?/?小鼠及其野生型同窝对照，以及D-半乳糖诱导的加速衰老小鼠模型；细胞实验使用MCF-10A和HEK-293 T细胞系。

研究结果部分如下：

2.1 USP25是衰老相关因子
Usp25^?/?小鼠寿命显著长于野生型同窝对照（对数秩检验，p=0.0313），5月龄和20月龄时转棒实验表现改善。20月龄小鼠肝脏USP25蛋白水平显著升高但mRNA水平不变，多柔比星处理的MCF-10A细胞中USP25蛋白同样升高而mRNA不变。USP25敲低显著减少多柔比星诱导的SA-β-gal阳性细胞比例及P21蛋白水平。RNA测序显示Usp25^?/?小鼠肝脏转录组发生显著改变，GSEA分析表明炎症和凋亡相关基因集显著抑制，提示USP25缺失有效抑制体内凋亡和炎症反应。

2.2 USP25缺失缓解小鼠衰老表型
10月龄Usp25^?/?小鼠体重和肝脏体重比降低，肺组织P21蛋白水平显著下降，P16和P21 mRNA水平一致改变，肝、肺、脑、心和肾等多器官P21表达降低，提示Usp25敲除有效改善小鼠衰老表型。骨组织分析显示ALP⁺成骨细胞数量显著增多、TRAP⁺破骨细胞数量减少，提示骨形成增强、骨吸收抑制，衰老相关骨丢失表型得到缓解。

2.3 USP25缺失缓解D-半乳糖诱导的衰老
在D-半乳糖（100 mg/kg，腹腔注射，每日一次，连续8周）诱导的加速衰老模型中，Usp25^?/?小鼠在基础和D-半乳糖处理条件下转棒表现均优于野生型对照，肝脏P21蛋白水平显著降低，P21积累减少，骨形成增强、骨吸收抑制，证实USP25敲除可改善D-半乳糖诱导的衰老。

2.4 USP25直接与SIRT1相互作用并去泛素化SIRT1
质谱分析鉴定SIRT1为USP25新发现的互作蛋白，Co-IP在HEK-293 T细胞中验证二者直接相互作用。USP25敲低或过表达（野生型或催化失活突变体USP25-C178S）均不影响SIRT1蛋白水平，表明USP25调控SIRT1活性而非稳定性。USP25敲低特异性增加SIRT1上K63连接的多聚泛素链而非K48连接，且在小鼠组织中得到验证，证实USP25介导K63连接去泛iquitin化而不影响SIRT1降解。

2.5 USP25缺失通过SIRT1介导的P53乙酰化和转录活性抑制细胞衰老
USP25敲低显著增加细胞SIRT1去乙酰化酶活性，且呈SIRT1依赖性。USP25与SIRT1双敲低细胞在多柔比星处理后SA-β-gal活性不再受USP25敲低影响。USP25敲低抑制P53在K382位点的乙酰化及PGC-1α乙酰化，降低P21表达。体内实验中，SIRT1特异性抑制剂EX527处理显著逆转Usp25^?/?小鼠肺组织P21阳性细胞比例下降、Ace-P53水平降低及SASP相关因子（MMP9、CXCL1、Serpine1）mRNA下调，证实USP25缺失通过SIRT1–P53依赖方式延迟细胞衰老并抑制SASP。

2.6 K506和K513是SIRT1泛素化的主要位点
质谱鉴定SIRT1的K506和K513为潜在泛素化位点，且这两个位点在人、小家鼠、褐家鼠、山羊、牛、马和欧洲兔中高度保守。构建K506R/K513R双突变体（SIRT1-2KR）后，USP25敲低不再增加该突变体的泛素化水平，且对P53乙酰化、P21表达、SA-β-gal活性及SIRT1去乙酰化酶活性的调控效应均消失，证实K506和K513是USP25调控SIRT1活性的主要去泛素化位点。

2.7 USP25通过DBC1调控SIRT1去乙酰化酶活性
DBC1（Deleted in breast cancer 1）是直接结合SIRT1并抑制其去乙酰化酶活性的核蛋白。Co-IP证实USP25敲低削弱SIRT1与DBC1的相互作用，且该效应依赖K506/K513位点的泛素化状态。USP25/DBC1双敲低细胞中，SIRT1野生型而非2KR突变体可挽救P53乙酰化水平的降低，表明K506和K513位点的泛素化对衰减SIRT1与DBC1的相互作用至关重要。

2.8 多肽介导的竞争性抑制USP25–SIRT1相互作用
通过构建SIRT1截断突变体进行分子映射，确定SIRT1的卷曲螺旋样（Coiled-coil-like, CC-like）结构域是与USP25相互作用不可或缺的区域。利用I-TASSER服务器预测结构并筛选多肽，SPR证实4条多肽（Sirt1-1至Sirt1-4）与USP25具有高结合亲和力。其中仅pSirt1-4能有效破坏内源性USP25–SIRT1相互作用。pSirt1-4处理增加SIRT1泛素化（野生型而非2KR突变体）、降低P53乙酰化和P21表达、增加SIRT1去乙酰化酶活性、减少SA-β-gal阳性细胞。体内实验中，pSirt1-4处理显著减少D-半乳糖诱导的P21阳性细胞比例和SA-β-gal活性，血清生化分析显示AST、UREA和CREA水平无明显变化，表明无明显肝毒性和肾毒性。

讨论部分总结指出，本研究证实USP25显著改善细胞衰老和年龄相关表型，建立了USP25通过K63连接去泛素化直接作用于SIRT1、经DBC1调控其去乙酰化酶活性、影响P53/PGC1α乙酰化及下游转录激活的完整机制模型。pSirt1-4多肽特异性破坏USP25–SIRT1相互作用，增加SIRT1去乙酰化酶活性，有效缓解体外和体内细胞衰老，且无明显毒性，展示了作为精准医学策略的潜力。值得关注的是，USP25敲除不影响小鼠胚胎发育或生存，而USP22敲除导致胚胎致死，这使USP25作为治疗靶点具有独特优势。研究局限性包括：EX527药理学验证不能完全重现基因敲除的持久性和组织特异性，理想方案需构建Usp25/Sirt1双敲除小鼠，但Sirt1全身敲除导致严重发育缺陷和围产期致死，需借助条件性敲除或组织特异性Cre策略；不能排除USP25通过USP25–SIRT1-p53轴之外的间接效应对免疫系统的影响；自然衰老条件下的证据仍不充分，需在不同衰老阶段和病理背景下采用条件性Usp25/Sirt1双敲除小鼠进行系统性研究，以更全面评估USP25–SIRT1信号轴作为抗衰老靶点的转化潜力。