低膳食磷摄入下斑马鱼牙齿形成与釉质样组织（enameloid）矿化不受影响：与骨矿化解耦的证据

《Developmental Dynamics》：Different from bone: Tooth formation and enameloid mineralization are not affected by reduced dietary phosphorus intake

　　

背景：脊椎动物依赖磷摄入完成骨骼矿化。在人类中，与佝偻病（rickets）、低磷血症（hypophosphatemia）、低磷酸酯酶症（hypophosphatasia）或特发性磨牙-切牙矿化不足（idiopathic molar-incisor hypomineralization）相关的牙齿矿化不足可造成显著问题。本研究在低、常规和高膳食磷（phosphorus, P）摄入条件下，检查野生型（wild-type）斑马鱼和骨钙素绿色荧光蛋白报告品系（osteocalcin GFP reporter-line, osc:GFP）斑马鱼的牙齿发育。研究人员通过茜素红S（Alizarin red S）染色、同步辐射X射线断层扫描（synchrotron X-ray tomography）、组织学切片的Von Kossa染色、拉曼显微光谱（Raman micro-spectroscopy）、纳米压痕（nanoindentation）、磷酸盐转运体基因表达检测及其他组织学技术，分析牙齿和颌骨基质的矿化。

结果：喂食低磷膳食的斑马鱼中，牙齿发育、釉质样组织（enameloid）和牙本质（dentin）形成以及骨基质沉积持续进行。然而，磷缺乏损害骨基质矿化，延迟牙本质矿化，而釉质样组织矿化不受影响。对已萌出牙齿的拉曼光谱显示牙本质矿物组成无变化。向量性Na-P共转运体（vectorial Na-P co-transporter）slc34a2b在成釉细胞（ameloblasts）中表达，这与已知该细胞对釉质样组织矿化的贡献一致。

结论：作者推测，成釉细胞的主动磷酸盐转运可能也参与牙本质矿化。所观察到的骨与牙齿矿化解耦与其他真骨鱼类（teleost species）在自然条件下的发现一致，也与斑马鱼和哺乳动物中损害骨矿化的实验室研究一致。

研究背景：脊椎动物骨骼矿化依赖膳食磷（P）摄入。已有研究表明，低膳食磷摄入可显著影响多种真骨鱼类的皮肤骨骼（如鳞片和真皮鳍条）及内骨骼（尤其是脊柱）矿化；在低磷条件下，椎体仍继续生长，但基质保持未矿化，鳞片仍形成环纹但基质未矿化，真皮鳍条亦继续生长而基质未矿化。牙齿与鳞片、鳍条同属皮肤骨骼元件，其形成需要上皮和间充质共同参与。由于原始水生有颌类在很大程度上不依赖膳食钙供应，有假说认为皮肤骨骼的初始功能可能是储存磷而非储存钙。然而，低膳食磷供应是否以及多大程度影响真骨鱼类牙齿形成尚不清楚。啮齿类实验显示，在钙供应充足时，切牙生长和矿化在很大程度上不受膳食磷减少影响；但在人类中，磷代谢相关疾病可导致牙齿矿化不足，包括多种低磷血症、低磷酸酯酶症和特发性磨牙-切牙矿化不足。因此，研究人员以牙齿结构研究较充分的斑马鱼（Danio rerio）为模型，研究低和高膳食磷摄入对牙齿发育、牙齿替换、牙齿结构和牙齿矿化的影响。

研究人员开展的研究及结论：研究人员以野生型（WT）AB斑马鱼和骨钙素绿色荧光蛋白报告品系（osc:GFP）斑马鱼为对象，从28天受精后（dpf）开始分别喂食低磷（low phosphorus, LP）、常规磷（regular phosphorus, RP）和高磷（high phosphorus, HP）三种定制饲料，并在实验开始前（T0）、喂养1个月和2个月后取样。研究显示，低膳食磷摄入不抑制牙齿发育和牙齿替换；但磷缺乏损害颌骨和牙基座（pedicel，又称bone of attachment）矿化，牙本质矿化延迟而釉质样组织（enameloid）矿化不受影响。高磷膳食可提高牙组织硬度和弹性模量，但拉曼光谱未显示牙组织矿物组成受膳食磷显著影响。slc34a2b在成釉细胞（ameloblasts）中表达，作者据此推测成釉细胞的主动磷转运可能解释低磷条件下釉质样组织矿化不受影响，并可能参与牙本质矿化。该研究揭示了骨与牙齿矿化对低膳食磷摄入的不同反应，即骨与牙齿矿化解耦，为理解骨和牙齿矿化调控差异提供了模型证据。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用WT AB斑马鱼（来自European Zebrafish Research Center）和osc:GFP斑马鱼（来自Dr. A. Willaert, Ghent University Hospital），以LP、RP、HP三种定制饲料喂养；饲料由SimplyFish AS和Danish Technological Institute配制，磷含量在University of Hohenheim验证；同步辐射X射线断层扫描在SLS的TOMCAT线站完成。方法包括茜素红S全染、Von Kossa/Van Gieson组织学、同步辐射X射线断层扫描、拉曼显微光谱、纳米压痕、osc:GFP荧光检测及slc34a2b原位杂交（in situ hybridization）。

研究结果：
Low dietary P-intake does not inhibit tooth development：通过茜素红S染色和牙齿大小比较发现，LP、RP和HP组均存在牙原基和发育牙，1或2个月膳食处理后腹侧牙（1V–5V）尺寸增大；低磷或高磷膳食均不影响牙齿形成本身或牙齿大小。
Tooth attachment：通过茜素红S全染和卡方检验发现，LP组约一半腹侧牙经非矿化牙基座附着；RP和HP组多数腹侧牙具有完全矿化牙基座，1个月时分别为71%和61%，2个月时分别为85%和87%；LP组非矿化牙基座附着比例显著高于RP和HP组。
Mineralization: dentin, pedicel and bone：通过对112个标本、1120颗牙的茜素红S全染、同步辐射X射线断层扫描及Von Kossa/Van Gieson染色发现，LP膳食1和2个月强烈降低颌骨和所有牙近端部分矿化；RP与HP组间无明显差异。LP组新萌出牙仅外周牙本质矿化，大量非矿化牙本质持续存在，但矿化在牙齿功能期内继续；RP和HP组牙本质矿化较均匀。各膳食组腹侧牙牙本质厚度相似，成牙本质细胞（odontoblasts）均具有伸入牙本质的细胞突起。
Dental tissues and enameloid mineral composition and hardness：通过拉曼显微光谱发现，各组织指纹相似，釉质样组织矿化程度高于牙本质、牙基座和咽骨；釉质样组织磷酸盐/酰胺III比和磷酸盐/CH₂比高于其他组织；釉质样组织碳酸盐/酰胺I比显著高于牙本质；咽骨碳酸盐/磷酸盐比显著高于牙本质；釉质样组织结晶度高于咽骨；膳食对拉曼参数无显著影响。纳米压痕显示咽骨组织刚度高于牙基座，并呈高于牙本质趋势；HP组牙组织硬度高于RP组，HP组组织刚度高于RP和LP组；牙基座矿化参数呈随膳食磷增加碳酸盐/磷酸盐均值升高、结晶度均值降低的趋势。
Osteocalcin expression in odontoblasts, osteoblasts and osteocytes：通过osc:GFP报告品系和荧光信号定量发现，各膳食组成牙本质细胞、成骨细胞（osteoblasts）、骨细胞（osteocytes）和骨衬细胞均表达骨钙素，成牙本质细胞和骨细胞突起亦有信号；成釉细胞在各牙齿发育阶段均无骨钙素表达；年轻功能牙1V和替换牙3V牙髓腔内GFP信号面积在各膳食组间无显著差异。
Enameloid mineralization and epithelial P transporter expression：通过茜素红S染色、同步辐射X射线断层扫描、Von Kossa染色和拉曼光谱发现，釉质样组织矿化不受低膳食磷影响。通过原位杂交发现，slc34a2b在牙尖成釉细胞中表达，早期和后期均可见，成牙本质细胞不表达；slc34a2b信号与骨钙素信号分布明显不同；鳃上皮细胞亦表达slc34a2b。未进行LP、RP和HP组间slc34a2b表达水平的半定量分析。

讨论部分总结：讨论指出，低膳食磷摄入导致斑马鱼骨矿化受损但骨基质形成继续，类似骨软化症（osteomalacia）；牙齿与骨矿化发生解耦，LP斑马鱼萌出牙具有矿化釉质样组织和矿化牙本质表面，而颌骨仅部分矿化。与其他研究中的骨与牙矿化解耦现象一致，如斑马鱼no bone（NOB）突变体和Enpp1-null小鼠仍可形成矿化牙。高膳食磷可提高牙组织硬度和刚度，但拉曼光谱未显示矿物组成显著改变；牙基座碳酸盐/磷酸盐比与结晶度的反向趋势提示其可能具有特定矿化机制。作者提出，成釉细胞表达slc34a2b，主动磷转运可解释低磷条件下釉质样组织矿化不受影响；成牙本质细胞和成骨细胞缺乏SLC34A家族向量性磷转运体，作者进一步推测成釉细胞的主动矿转运可能贡献牙本质矿化。低磷条件下牙本质矿化延迟、牙基座和骨非矿化，与早期有颌类及现存真骨鱼中非矿化牙附着现象相似。

研究结论翻译：先前和当前针对斑马鱼以及先前针对大西洋鲑（Salmo salar）的实验均显示，低膳食磷摄入相关明显矿化缺陷。骨矿化受损但骨基质形成继续。可以认为，基质沉积和骨性骨骼元件形成可与矿化解耦。本研究表明，在低膳食磷摄入条件下，斑马鱼牙齿器官发生和牙齿替换继续。与骨不同，牙齿确实发生矿化。牙本质矿化延迟但未被阻断，而釉质样组织矿化不受低膳食磷摄入影响。作者推测，如同哺乳动物，上皮细胞即成釉细胞的主动离子转运促进釉质样组织矿化，并可能参与牙本质矿化。