受损小麦籽粒经优化酸水解后利用乳杆菌发酵生物合成聚(3-羟基丁酸酯)（PHB）的研究

《Food Science & Nutrition》：Bioprocessing of Damaged Wheat Grain Into PHB Using Lactobacillus Fermentation Following Optimized Acid Hydrolysis

　　

论文摘要专业翻译 本研究建立了一种可持续的策略，利用受损小麦籽粒（damaged wheat grain, DWG）作为替代性非粮食农业工业底物，用于聚(3-羟基丁酸酯)（poly(3-hydroxybutyrate), PHB）的生物合成。该集成方法涉及系统优化盐酸（HCl）介导的水解过程，随后利用乳杆菌属（Lactobacillus）菌种进行微生物发酵。研究人员对水解参数（包括时间、酸与样品比、HCl浓度和底物装载量）进行了评估，以最大化还原糖（reducing sugar, RS）的释放，同时抑制发酵抑制物的形成。在45 min、20% w/v酸与样品比、6% w/v HCl和20% w/w底物装载量的条件下实现了最佳营养回收，获得336.66 ± 1.14 mg葡萄糖当量/g RS和4.67% ± 0.07% w/w蛋白质。在这些优化条件下，乙酸、甲酸、糠醛和5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF）的抑制浓度被有效限制在2.36、6.95、0.49和1.17 mg/g。随后，利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）组成的菌群对精制水解液进行发酵。在30°C、6%接种量、96 h的条件下，FH12实现了最大PHB滴度1.85 ± 0.42 g/L。这些结果表明，通过优化的乳酸菌发酵将低价值农业废弃物转化为生物聚合物的可行性，为循环生物经济应用提供了一条可行途径。

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一、研究背景与意义

聚(3-羟基丁酸酯)（poly(3-hydroxybutyrate), PHB）作为聚羟基烷酸酯（polyhydroxyalkanoates, PHA）家族的重要成员，因其可生物降解性和与部分传统塑料相当的机械性能，被视为石油基聚合物的理想替代品。PHB是由3-羟基丁酸酯重复单元通过酯键连接而成的胞内微生物聚酯，可在土壤、水体或堆肥环境中被微生物分解为二氧化碳和水。然而，PHB的工业化应用长期受限于其高昂的生产成本。降低PHB生产成本的有效策略之一是采用廉价且可再生的原料作为发酵底物。在此背景下，农业废弃物因其来源丰富、成本低廉且常被低效利用而受到日益广泛的关注。受损小麦籽粒（damaged wheat grain, DWG）作为一种富含木质纤维素组分（主要为纤维素、半纤维素和木质素）的未充分利用农业残留物，具有作为非粮食底物生产生物聚合物的潜力。将农业副产品转化为PHB具有双重优势：既能实现废弃物资源化利用，又能生产环境友好的可生物降解塑料，同时有助于减少垃圾填埋、露天焚烧及相关温室气体排放。

然而，将木质纤维素类残留物转化为PHB，首先需要对生物质进行预处理和水解以释放可发酵糖。水解过程必须严格控制，以在最大化糖释放的同时尽量减少糠醛、5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF）和有机酸等抑制性化合物的生成。已有研究表明，盐酸（HCl）水解是转化受损小麦籽粒为可发酵底物的有效策略。此外，虽然已有多种微生物被探索用于PHB生物合成，但利用乳杆菌属（Lactobacillus）菌群从受损小麦籽粒水解液中生产PHB的研究仍十分有限。乳杆菌菌群凭借代谢互补性、混合糖利用中的分工协作以及对有机酸和水解液衍生胁迫的增强交叉保护，为生物转化提供了有前景的平台。在酸胁迫下的协同作用可将多余的碳和还原当量引导至PHB合成，作为胞内氧化还原库，从而获得比单菌株发酵更高的生物聚合物产量。因此，本研究旨在探索受损小麦籽粒水解液转化为PHB的集成路径，作为一种可持续的废弃物增值策略。

二、研究内容概述

研究人员开展了从受损小麦籽粒经盐酸水解和乳杆菌发酵生产PHB的全流程研究。首先对受损小麦籽粒的化学组成、矿物质和重金属含量进行了系统表征；随后系统优化了盐酸水解条件，评估了时间、酸与样品比、HCl浓度和底物装载量对还原糖释放、蛋白质保留和抑制物形成的影响；接着利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）组成的菌群对优选水解液进行发酵，考察了温度、接种量和发酵时间对PHB产量的影响；最后对合成的PHB进行了全面的理化表征。

三、关键技术与方法

研究人员采用了以下主要关键技术方法：利用ICP–OES（电感耦合等离子体–光学发射光谱法）测定受损小麦籽粒的矿物质和重金属含量；采用DNS（3,5-二硝基水杨酸）法测定水解液中还原糖浓度；采用Lowry法测定蛋白质含量；利用HPLC（高效液相色谱法）定量乙酸、甲酸、糠醛和5-HMF等抑制物；通过UV–Vis（紫外–可见）分光光度法对PHB进行定量；采用NMR（核磁共振）、FTIR（傅里叶变换红外光谱）、TGA/DTA/DTG（热重分析/差热分析/导数热重分析）、XRD（X射线衍射）和SEM（扫描电子显微镜）对PHB进行结构、热性能和形貌表征。受损小麦籽粒来源于伊朗卡拉季的一个青贮设施。

四、研究结果

4.1 受损小麦籽粒的特性

受损小麦籽粒的近似组成为：水分13.86% ± 0.26%、碳水化合物50.97% ± 0.37%、粗脂肪0.99% ± 0.09%、蛋白质3.99% ± 0.23%、粗纤维24.34% ± 0.43%和灰分5.91% ± 0.21%。该结果表明受损小麦籽粒含有可观的碳水化合物和纤维组分，支持其作为低成本发酵底物的潜力。矿物质分析显示，元素谱以K（4153.48 μg/g）、P（3254.78 μg/g）、Mg（1191.18 μg/g）和Ca（512.91 μg/g）为主。重金属分析显示Cd（0.01 μg/g）、Hg（0.05 μg/g）和Pb（0.17 μg/g）浓度较低，表明该样品具有相对较低的有毒金属负荷。

4.2 水解条件优化与优选水解液

研究人员对27种水解处理组合（HDWG1–HDWG27）进行了考察。其中HDWG4（6% HCl、20% w/w底物装载量、20% v/w酸与样品比、45 min）被选为最适水解液，其还原糖产量为336.66 ± 1.14 mg葡萄糖当量/g干重，蛋白质含量为4.67% ± 0.07% w/w，乙酸、甲酸、糠醛和5-HMF浓度分别为2.36、6.95、0.49和1.17 mg/g。相比之下，HDWG26（15 min、10%酸与样品比、6% HCl、20%底物）表现出最低的还原糖浓度（172.85 mg/g）和蛋白质含量（3.81% w/w），同时具有最高的抑制物浓度，表明过度水解严重度有利于糖降解和抑制物生成而非有效糖回收。

4.3 发酵参数对PHB产量的影响

研究人员考察了温度（30°C和60°C）、接种量（3%、6%和9%）和发酵时间（24–120 h）对PHB积累的影响。统计分析表明，温度、接种量和发酵时间均显著影响PHB产量（p < 0.05）。最大PHB浓度1.85 ± 0.42 g/L在FH12处理中获得，条件为30°C、6%接种量、96 h。温度升高至60°C导致PHB浓度降低约48%–59%，这与乳杆菌属的中温特性一致。6%接种量提供了初始代谢活性细胞数与水解液可用营养之间的有利平衡；3%接种量可能因初始生物量不足而延迟底物同化和聚合物积累，9%接种量则可能因营养消耗过快、细胞间竞争加剧或有机酸生成增多而降低PHB产量。PHB积累随发酵时间增加至96 h达到最大值，随后在120 h显著下降，可能与易同化还原糖耗竭及随后PHB作为碳和能量储备被动员有关。

4.4 PHB表征

NMR分析确认了PHB的特征结构，1H-NMR谱显示δ 1.7–1.9 ppm处亚甲基和甲基的脂肪族质子共振，以及δ 5.0–5.2 ppm处与酯键相邻的次甲基（–CH–）基团信号；13C-NMR谱在酯键相邻亚甲基碳、δ 71–75 ppm中心次甲基碳以及羰基碳（C=O）处显示主要信号，与文献PHB标准高度一致。FTIR分析显示1732 cm?1处强吸收峰归属于酯羰基（C=O）伸缩振动，1174和1009 cm?1处为C–O–C伸缩振动，921 cm?1处为与PHB结晶区相关的C–C和C–O振动，整体谱图与商业PHB标准高度吻合。热分析显示，TGA曲线呈现以约270°C为起始的单一阶段质量损失事件，主降解区约为270°C–340°C；DTA在184°C处显示对应PHB熔融温度（T_m）的吸热峰，随后在289°C处出现与聚合物分解相关的尖锐放热峰；DTG曲线显示最大降解速率出现在约350°C，总质量损失约55%，表明FH12来源的PHB具有改善的热稳定性。

五、讨论与结论

本研究中最大PHB浓度1.85 ± 0.42 g/L高于Sirohi等人（2021）利用Bacillus sp. NII2在酶解受损小麦籽粒上报道的1.305 g/L，表明乳杆菌菌群在受损小麦籽粒水解液中的PHB生产潜力。HDWG4水解液提供了高浓度可发酵糖，同时维持相对较低的糠醛、5-HMF、乙酸和甲酸浓度，为微生物生长和PHB生物合成提供了有利条件。然而，由于未测定各处理组的残余糖、生物量浓度和有机酸产量，部分机制解释应视为合理推测而非直接验证的结论。初始pH 7.0可能为菌群提供了适宜的起始条件，但发酵过程中未监测pH变化，无法确认初始pH是否防止了培养过程中的酸化。研究结果表明，酸水解受损小麦籽粒可作为乳杆菌菌群生产PHB的有前景的实验室规模底物。该研究首次报道了利用这些乳杆菌菌种从受损小麦籽粒水解液生产PHB，为低值农业废弃物转化为生物聚合物提供了可行途径，对循环生物经济应用具有潜在价值。然而，在考虑放大或工业化应用之前，仍需开展糖消耗动力学、生物量产率、PHB生产率、聚合物回收率、分子特性、残余抑制物转移、技术经济评估和环境绩效等方面的进一步研究。