Pholiota adiposa双核T2T基因组揭示核功能分化与菌盖颜色变异的遗传基础

《Microbial Biotechnology》：Nuclear Functional Divergence and Genetic Basis of Cap Colour Variation Revealed by T2T Genomes of Two Compatible Monokaryons in Pholiota adiposa

　　

担子菌真菌在其整个生命周期中维持双核状态，即两个遗传上不同的单倍体细胞核共存于同一细胞质中。然而，核间基因组差异的程度及其功能意义仍知之甚少。本研究首次报道了从野生黄伞（Pholiota adiposa）分离株中获得的两个可亲合单核体（D1和D11）的端粒到端粒（telomere-to-telomere, T2T）组装，实现了13条完整染色体的零缺口组装，基准通用单拷贝直系同源（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs, BUSCO）完整性分别达到98.6%和98.3%，显著优于此前碎片化的基因组组装。两个细胞核仅表现出75%的共线性基因，分别含有570个（D1）和668个（D11）菌株特异性基因。D1特异性基因富集于能量代谢通路，与其更快的菌丝生长速度一致；而D11特异性基因富集于遗传信息处理和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路，揭示了两个单倍体细胞核之间的功能互补性。对18份野生种质的重测序分析在6号和12号染色体上鉴定出两个与红色菌盖颜色相关的候选区域，前者为主要效应位点，后者包含多个色素相关基因。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析表明苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢和萜类生物合成参与颜色形成，提示颜色调控涉及跨代谢网络的协同调控。这一研究框架有助于解析细胞核功能分化，并为理解真菌表型变异提供了候选靶点。

研究背景与科学问题

担子菌真菌在其生活史的大部分阶段维持双核状态——两个遗传上不同的单倍体细胞核共存于同一细胞质中，并通过锁状联合结构同步分裂。尽管这种“同居分治”的核组织形式是真菌生命活动的核心特征，但两个细胞核如何在基因组层面实现功能分工、维持基因组完整性并协调生长发育，其分子机制尚不明确。黄伞（Pholiota adiposa）是一种兼具食用和药用价值的特色栽培真菌，但其基因组资源严重匮乏——公共数据库中已有的基因组组装（GCA_014526955.1）仍处于contig水平，N50低于1 Mb，缺乏染色体尺度的分辨率。同时，菌盖颜色作为重要的商品性状，其遗传基础在该物种中尚未被探索。因此，构建高质量的双单倍体参考基因组，对于解析担子菌双核体的核间功能分化机制以及揭示菌盖颜色变异的遗传基础具有重要意义。

研究内容与主要结论

研究人员从野生黄伞分离株HS5（BIPP21160005）出发，通过原生质体再生技术获得两个可亲合的单核体菌株D1和D11，并整合PacBio HiFi、Oxford Nanopore Technologies（ONT）超长读段和Hi-C数据，完成了该物种首个端粒到端粒（T2T）水平的双单核体参考基因组组装。比较基因组学分析揭示了两个细胞核间的共线性保守性和基因功能分化，全基因组重测序则用于鉴定与红色菌盖颜色相关的候选基因组区域。研究结果表明，两个细胞核之间存在明显的功能特化：D1偏向能量代谢与快速营养生长，D11则偏向基因组维护与交配信号感知，为担子菌双核体的核功能分工提供了基因组层面的证据。此外，在6号和12号染色体上鉴定出两个与红色菌盖颜色相关的候选区域，提示菌盖色素沉着受多代谢网络协同调控。

关键技术方法

1. 1.
   原生质体单核化与配对实验：从野生双核分离株HS5通过溶壁酶消化细胞壁获得原生质体，经再生后筛选无锁状联合的菌落作为推定单核体，通过配对交配实验确定可亲合组合D1和D11。
2. 2.
   多平台测序与T2T基因组组装：采用PacBio HiFi、ONT超长读段和BGI短读段进行全基因组测序，结合Hi-C数据进行染色体锚定，利用Hifiasm进行混合组装，经NextPolish抛光、purge_dups去冗余、3D-DNA和Juicebox人工校正，最终通过TGS-GapCloser填补缺口，实现零缺口染色体级别组装。
3. 3.
   基因组注释与比较基因组学分析：综合从头预测、同源比对和转录组辅助策略进行基因注释，使用MCScanX检测共线性关系，通过双向BLAST鉴定基因组特异性基因，并进行GO和KEGG富集分析。
4. 4.
   群体基因组学与关联分析：对18份野生种质（来自北京、河北、甘肃、内蒙古、青海、江苏等地）进行全基因组重测序，以D1和D11为独立参考基因组进行SNP calling，采用邻接法构建系统发育树，通过固定指数（FST）滑动窗口分析和菌株特异性SNP定位鉴定红色菌盖颜色候选区域。

研究结果

3.1 两个端粒到端粒单倍体基因组建立了双核比较的配对参考

D1基因组由13条染色体组成，总长46.66 Mb；D11基因组同样包含13条染色体，总长47.63 Mb。两个组装均实现100%染色体锚定且无序列缺口，分别在25个染色体末端检测到端粒重复序列（CCCTAAA），并在所有13条染色体上鉴定出着丝粒区域。BUSCO完整性分别为98.6%（D1）和98.3%（D11），显著优于此前公共数据库中的碎片化组装。重复元件占D1基因组的18.64%和D11基因组的20.45%，其中长末端重复逆转录转座子为主要类别。功能注释预测D1含14,204个蛋白编码基因，D11含14,353个。

3.2 高共线性保守性与广泛的核间基因含量分歧

MCScanX共线性分析显示，两个基因组的13条染色体呈现清晰的一一对应关系，未检测到染色体水平的易位或大规模重排，这与在其他担子菌中观察到的广泛染色体重排形成对比。共鉴定出21,418个共线性基因，占所有预测基因的75.0%。这些共线性基因主要富集于RNA加工、核糖体生物发生、基因表达调控和蛋白质生物合成等基本细胞过程。非共线性基因在D1中有3,494个，在D11中有3,648个。

3.3 亚端粒区和着丝粒区基因组特异性基因的富集揭示核功能特化

从非共线性区域中鉴定出D1特异性基因570个，D11特异性基因668个。这些基因高度不均匀地分布于染色体上，绝大多数集中在亚端粒区域，少量位于着丝粒区域。功能富集分析显示，D1特异性基因显著富集于氧化磷酸化、线粒体电子传递和氨基酸代谢等能量代谢通路；D11特异性基因则富集于DNA复制、同源重组、DNA修复和MAPK信号通路。这一功能分化与表型差异相吻合：D1在PDA培养基上的菌丝生长速率显著快于D11。

3.4 群体基因组变异汇聚于亚端粒和交配型热点区域

基于D1和D11作为独立参考基因组的SNP calling获得的系统发育树拓扑结构高度一致。SNP的染色体分布呈现显著的非随机模式：近染色体末端区域SNP密度显著升高，中央区域变异水平较低。交配型位点（包括HD类和RCB类基因）位于SNP密度最高的基因组区间内，反映了长期平衡选择的作用。

3.5 两个与红色菌盖颜色相关的候选区域揭示色素代谢的多基因协同调控

菌株BIPP21160034呈现独特的深红色菌盖表型，主成分分析将其与其他17份种质明显区分。通过菌株特异性SNP鉴定和全基因组FST分析，在6号染色体1.29–1.53 Mb区间和12号染色体1.93–2.58 Mb区间鉴定出两个候选区域。6号染色体区域呈现最强的群体分化信号（FST峰值），包含3个携带错义突变的颜色相关基因（FAD依赖性单加氧酶、细胞色素P450单加氧酶、热休克转录因子HSF）。12号染色体区域虽无显著FST峰，但包含23个携带错义突变的色素相关基因，涉及酪氨酸酶、酚羟化酶、O-甲基转移酶（OMT）、短链脱氢酶/还原酶（SDR）、Zn(2)-Cys(6)转录因子和主要协助转运蛋白超家族（MFS）转运蛋白等。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究构建的首个配对T2T参考基因组为解析担子菌双核遗传学提供了高质量框架。与二倍体园艺作物中同源染色体序列一致性超过99%不同，黄伞两个细胞核间约25%的基因为非共线性，远超出等位基因差异的范围。值得注意的是，群体基因组分析基于D1和D11作为独立参考获得了高度一致的系统发育拓扑结构和SNP分布，证实了两个组装均能有效捕获群体多样性。基因组特异性基因的功能分化与表型差异相吻合，将D1的快速生长与能量代谢基因联系起来，将D11的缓慢生长与基因组维护功能联系起来。着丝粒区域的基因组特异性基因富含转座元件，这得益于减数分裂重组在着丝粒邻近区域的强烈抑制。关于菌盖颜色，6号染色体被认为是主要候选区域，12号染色体则可能通过多个色素相关基因的协同作用发挥次要效应，提示红色菌盖表型并非由单一基因控制，而是由多个色素代谢网络的协同调控所决定。

结论部分翻译如下：本研究首次为具有重要食用和药用价值的担子菌黄伞提供了配对的端粒到端粒参考基因组。两个可亲合的单倍体细胞核表现出功能互补性，一个细胞核特化于能量代谢，另一个特化于遗传信息处理和交配信号传导，揭示了核特化是双核真菌的一种基因组设计原则。群体基因组分析鉴定出两个与红色菌盖颜色相关的候选区域，表明真菌色素沉着受多个代谢网络的协同调控而非单一途径控制。这些发现确立了黄伞作为研究担子菌核功能分化的有价值模型，并为理解真菌表型变异提供了基因组资源。配对单倍体参考框架将促进该商业重要物种在双核协调、次生代谢和标记辅助育种方面的未来研究。