零价铜纳米酶水凝胶促进糖尿病创面愈合的抗氧化与铜离子协同机制研究

《Materials Today Advances》：Zero-valent copper nanozymes hydrogels promote diabetic wound healing

　　

摘要专业翻译 持续性氧化应激、炎症和血管生成受损会延迟糖尿病创面的修复。含铜材料可通过氧化还原化学和铜递送两种途径影响上述过程。本研究将零价铜（Cu0）纳米酶掺入海藻酸盐水凝胶（Cu0@Alg）中，将抗氧化活性与Cu+生成反应性相结合。比色法测定显示，在含Cu2+的溶液中，Cu0可提高所测得的Cu+浓度，同时该水凝胶保留了自由基清除活性以及超氧化物歧化酶（SOD）样和过氧化氢酶（CAT）样活性。该水凝胶具有多孔、吸水的结构，在储存期间保持Cu+生成活性，并在14天内持续释放铜。体外实验中，在标称暴露浓度为0.5 μmol mL?1时，Cu0促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移和管状结构形成，同时伴随缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）表达升高。在RAW264.7巨噬细胞中，标称暴露浓度为0.25 μmol mL?1的Cu0降低了促炎标志物并增加了修复相关标志物。在糖尿病全层皮肤创面模型中，Cu0@Alg在12天内加速创面闭合、减少氧化损伤、增加血管相关染色和胶原沉积。上述结果支持Cu0@Alg作为一种用于糖尿病创面修复的抗氧化含铜敷料。研究提出Cu0/Cu2+归中反应是溶液中Cu+生成的贡献因素之一；然而，该反应在体内是否发生及其对创面修复的贡献尚未被直接证实。

论文解读

一、研究背景与科学问题

糖尿病创面愈合是临床面临的重大挑战，其病理机制涉及多重因素的交织作用。持续性氧化应激是核心驱动因素之一：过量的活性氧（ROS）损伤细胞组分，损害角质形成细胞迁移、基质沉积和内皮细胞功能。与此同时，创面局部呈现持续性炎症状态，巨噬细胞极化失衡，促炎表型占主导，进一步阻碍组织修复进程。此外，血管再生不足导致创面局部缺血缺氧，营养物质和氧气供应匮乏，使愈合过程陷入恶性循环。

铜作为多种抗氧化防御和组织修复酶的辅因子，其生物学效应依赖于严格的结合、转运和细胞内分布调控。含铜敷料和金属-多酚水凝胶已被开发用于支持抗氧化活性、免疫调节和血管生成。然而，既往铜基纳米酶多采用配体介导的电荷转移来调控铜价态和ROS清除活性，铜基纳米反应器则将细胞内铜处理与修复相关信号联系起来。值得注意的是，糖尿病创面组织中总铜含量升高，而应激成纤维细胞中细胞内Cu⁺探针信号减弱，提示铜的可利用性和氧化还原化学状态是创面材料设计的重要变量。

零价铜（Cu⁰）提供了一条通过归中反应（Cu⁰ + Cu²⁺ ? 2Cu⁺）生成Cu⁺的潜在途径。该反应的方向和程度取决于化学环境，包括配体对Cu⁺的稳定化作用。归中反应已在含氯铜体系和工程化铜界面得到证实。基于此，研究人员将Cu⁰纳米酶掺入海藻酸盐水凝胶（Cu⁰@Alg），考察其在含Cu²⁺溶液中生成Cu⁺的能力，同时保留抗氧化活性，并系统评估其体外细胞响应和糖尿病小鼠创面愈合效果。

二、研究内容与核心发现

研究人员制备了Cu⁰纳米酶并将其掺入海藻酸盐水凝胶中，对材料的理化性质、抗氧化活性、溶液相铜化学、体外细胞响应和体内创面愈合效果进行了系统研究。主要发现包括：Cu⁰@Alg具有多孔吸水结构、自由基清除活性、SOD样和CAT样活性以及持续14天的铜释放能力；在体外，Cu⁰促进HUVEC迁移和管状结构形成，伴随HIF-1α和VEGF表达升高，并使巨噬细胞标志物向修复相关表型转变；在糖尿病全层皮肤创面模型中，Cu⁰@Alg加速创面闭合、减少氧化损伤、增加胶原沉积和血管相关标志物染色。该研究的重要意义在于提出了一种将金属铜起始相的反应性与水吸收递送基质相结合的敷料设计策略，为糖尿病创面修复提供了新的材料思路。

三、主要技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：X射线衍射（XRD）结合Rietveld精修进行物相分析；X射线光电子能谱（XPS）和俄歇电子能谱（Cu LMM）表征表面化学状态；扫描电子显微镜（SEM）结合能量色散X射线光谱（EDS）进行形貌和元素分布分析；动态光散射（DLS）和Zeta电位表征纳米颗粒分散性质；电子自旋共振（ESR）光谱检测自由基清除活性；ABTS和DPPH自由基清除实验、SOD样和CAT样活性实验评估抗氧化性能；双辛可宁酸（BCA）比色法检测Cu⁺生成；体外细胞实验采用CCK-8活力检测、管状结构形成实验、划痕迁移实验、免疫荧光染色和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）；体内实验采用链脲佐菌素诱导的糖尿病C57BL/6小鼠全层皮肤缺损模型（每组3只，来自浙江实验动物中心），结合组织学染色（H&E、Masson三色）和组织免疫荧光分析。

四、研究结果

2.1 Cu⁰纳米酶的结构表征和自由基清除活性

SEM和EDS显示颗粒状结构且Cu元素定位于颗粒中。XRD显示结晶态金属铜的特征反射，Rietveld精修鉴定Cu为主要结晶相（约82%），同时含Cu₂O（6–7%）和CuO（11%）。DLS测得体积加权平均水动力直径为374.97 ± 24.30 nm，Zeta电位为20.32 ± 0.93 mV。XPS检测到Cu和含氧表面物种。ESR光谱显示Cu⁰处理后羟基自由基和超氧自由基信号减弱。Cu⁺生成活性受储存条件影响，密封避光储存14天保留率为89.26 ± 6.87%。

2.2 水凝胶性质、抗氧化响应和溶液相铜化学

Alg和Cu⁰@Alg均形成完整水凝胶，SEM显示多孔冻干网络，EDS检测到Cu⁰@Alg结构内的Cu。24小时溶胀率分别为489.36 ± 65.31%和462.43 ± 35.01%，14天质量损失分别为48.37 ± 5.84%和46.43 ± 2.29%，压缩模量分别为20.87 ± 1.61和23.89 ± 5.05 kPa。在400 μg/mL Cu⁰当量下，Cu⁰@Alg的ABTS和DPPH清除率分别为78.26 ± 3.86%和66.68 ± 2.25%，远高于Alg的8.06 ± 1.58%和7.09 ± 1.36%。BCA吸光度随时间增加，120分钟后Cu⁰ + Cu²⁺组测得83.20 ± 5.34 μM Cu⁺，而Cu⁰单独组为4.03 ± 0.52 μM，Cu²⁺单独组为0.43 ± 0.96 μM。铜释放持续14天，第14天释放介质中总铜为5.359 ± 0.309 μg/mL，溶解铜为4.400 ± 0.343 μg/mL。

2.3 Cu⁰促进内皮细胞血管生成表型

在0.5 μmol/mL标称暴露浓度下，Cu⁰处理的HUVEC形成更广泛的管状网络，毛细血管长度和分支点数量均增加。Cu⁰还增加了24小时划痕闭合率。免疫荧光和qRT-PCR显示HIF-1α和VEGF表达升高。

2.4 Cu⁰改变巨噬细胞炎症和修复标志物

在0.25 μmol/mL标称暴露浓度下，Cu⁰处理RAW264.7细胞后CD86荧光降低、CD206荧光升高。iNOS和TNF-α mRNA表达降低，IL-1β和TNF-α蛋白水平降低，ARG-1和IL-10蛋白水平升高，表明巨噬细胞向修复相关表型转变。

2.5 Cu⁰@Alg加速糖尿病创面闭合和组织重建

在糖尿病全层皮肤创面模型中，Cu⁰@Alg在早期观察点加速创面闭合。第12天H&E染色显示创面宽度更窄，Masson三色染色显示胶原沉积增加、创面组织厚度降低。

2.6 氧化损伤、巨噬细胞标志物和血管相关组织响应

Cu⁰@Alg组创面组织中8-OHdG染色和荧光强度降低，CD86信号降低、CD206信号升高，CD31和α-SMA染色增加。心、肝、脾、肺、肾的代表性H&E切片未见明显治疗相关结构病变。

五、讨论与结论

讨论部分指出，Cu⁰@Alg的抗氧化活性来自材料加可溶性物种的协同贡献，而非仅归因于未变化的金属表面。Cu₂O和CuO相的存在使Cu⁺生成的机制解释需谨慎，Cu⁰/Cu²⁺归中反应是合理途径，但氧化物相关贡献尚未明确区分。铜转运和转录调控为铜可用性与细胞表型之间提供了合理联系，但HIF-1α/VEGF表达升高并不证明该通路是必需的。高糖环境可破坏内皮氧化还原稳态，Cu⁰在高糖培养条件下增强HUVEC迁移和网络形成，与体内CD31和α-SMA染色增加相对应。研究局限性包括：未包含实验性感染模型；每组仅3只小鼠限制了效应估计精度；12天观察期无法确定成熟瘢痕质量、抗再开裂能力和持久功能性血管恢复；小鼠切除创面与机械负荷的人体糖尿病溃疡存在差异。

研究结论：掺入海藻酸盐的Cu⁰纳米酶形成了具有自由基清除活性、SOD样和CAT样测定响应以及持续铜释放的多孔水凝胶。比色测定在Cu⁰加入含Cu²⁺溶液时检测到Cu⁺，与测试条件下可能的归中反应途径一致。体外实验中，Cu⁰促进内皮迁移和管状结构形成，并使巨噬细胞标志物向修复相关表型转变。Cu⁰@Alg还改善了糖尿病小鼠的早期创面闭合、胶原沉积和血管相关染色。上述结果支持Cu⁰@Alg作为抗氧化含铜敷料的进一步开发。