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中文翻译：弗里德赖希共济失调（FRDA）是一种进行性神经退行性疾病，由Frataxin（FXN）基因中（GAA•TTC）n重复序列扩增引起，导致Frataxin蛋白（一种对能量产生和铁硫簇组装至关重要的线粒体蛋白）表达减少。微型环（MC）是非病毒DNA载体，与
中文翻译：弗里德赖希共济失调（FRDA）是一种进行性神经退行性疾病，由Frataxin（FXN）基因中（GAA•TTC）n重复序列扩增引起，导致Frataxin蛋白（一种对能量产生和铁硫簇组装至关重要的线粒体蛋白）表达减少。微型环（MC）是非病毒DNA载体，与传统质粒相比具有更高的安全性和效率。研究人员采用了一种新方法，利用生物素偶联的三链体形成和链入侵寡核苷酸（ONs）来纯化MC。将一段21 bp的H-DNA形成序列引入质粒中，以增强ONs的结合特异性。ON-质粒复合物通过链霉亲和素磁珠去除。该方法获得了高纯度的MC。在FRDA患者来源的成纤维细胞中，纯化的MC表达了FXN mRNA，并将Frataxin蛋白水平恢复至健康细胞中观察到的水平，证明了该方法的治疗潜力。更有趣的是，通过流体力学尾静脉注射MC-FXN治疗FRDA小鼠模型，小鼠肝脏和心脏中的Frataxin分别增加了18倍和3倍，支持了该方法的转化相关性。
论文解读
一、研究背景与目的
弗里德赖希共济失调（FRDA）是欧洲人群中最为常见的常染色体隐性遗传性共济失调，发病率约为1/29000。绝大多数患者携带两个不稳定的（GAA•TTC）n重复序列等位基因，该重复序列位于9号染色体Frataxin（FXN）基因的第一个内含子中。少数患者为复合杂合子，即一个等位基因存在（GAA•TTC）n扩增，另一个等位基因存在点突变。重复序列的数量与发病年龄呈反比，与疾病严重程度直接相关。此外，重复序列数量在不同组织中存在差异，提示患者衰老过程中存在细胞类型特异性的体细胞不稳定性。
FXN基因在细胞核中编码为210个氨基酸（aa）的前体蛋白，导入线粒体后经线粒体加工肽酶成熟为130 aa的成熟FXN。FXN作为铁伴侣蛋白，在铁硫（Fe-S）簇蛋白组装中发挥重要作用，通过维持适当的铁水平并抑制活性氧（ROS）的形成，保护细胞免受氧化应激和损伤。FRDA主要受累组织为神经系统，FXN缺乏导致背根神经节（DRG）、小脑齿状核、脊髓背柱及脊髓小脑束和皮质脊髓束中的细胞变性。此外，心脏和胰腺也是FRDA的受累组织，心脏中肌肉结构和功能受损导致肥厚型心肌病，心力衰竭是患者死亡的主要原因；胰腺中FXN表达降低导致胰岛素抵抗，最终发展为糖尿病。
目前FRDA的治疗选择有限。Omaveloxolone（Skyclarys?）作为Nrf2激活剂，通过减少氧化应激和改善线粒体功能，成为首个获批的FRDA药物。基因替代疗法如基因治疗为FRDA提供了潜在的治疗途径，但病毒载体存在免疫原性、包装容量有限和潜在的插入突变风险。微型环（MC）载体作为一种非病毒基因治疗递送平台，因其安全性好和基因表达持久而具有前景。去除MC DNA载体中的细菌骨架序列可显著增强和延长体内转基因表达。然而，实现高纯度MC的产量具有挑战性，残留污染物约占0.5%–1.5%，需满足监管要求。
二、研究内容与结论
本研究旨在优化三链体寡核苷酸（TFO）杂交和纯化程序，以生产纯化的MC DNA载体，并评估表达FXN的MC作为FRDA潜在治疗干预手段的效果。研究探索了最佳TFO设计、杂交条件和纯化方法的选择，以提高MC制备的效率和纯度。使用生物素化TFO进行载体纯化可确保有效去除不需要的细菌序列，增强治疗手段的安全性。此外，通过FXN表达MC在患者来源成纤维细胞和疾病动物模型中上调FXN表达的能力，探索了其作为FRDA靶向基因治疗方法的潜力。
三、主要技术方法
研究人员使用了多种关键技术方法：采用含21个GAA•TTC重复序列（21 bp）的H-DNA形成序列作为靶标，设计并合成了线性及钳形（clamp）三链体形成寡核苷酸（TFO）和链入侵寡核苷酸（ONs），包括生物素化的CTT TFO和钳形ONs。通过电泳迁移率变动分析（EMSA）和BQQ-OP（苯并喹喔啉-1,10-邻菲咯啉）三链体特异性切割实验评估杂交效率。使用链霉亲和素包被的磁性微珠（MyOne C1、MyOne T1和M-280）进行MC纯化。采用多重qPCR定量残留质粒（PP）和质粒骨架（PB）污染物。细胞实验使用来自Coriell研究所的GM03816 FRDA患者原代成纤维细胞（携带约330/380个GAA•TTC重复序列）和来自弗里德赖希共济失调细胞系库（FACLR）的健康6718成纤维细胞（6/6个重复序列）。动物实验使用Fxnnull::YG8s(GAA)>800（YG8JR）FRDA小鼠模型，通过流体力学尾静脉注射递送MC-FXN。
四、研究结果
优化ONs和杂交条件：通过凝胶位移实验评估线性15核苷酸TFO（Linear 15）、线性21核苷酸TFO（Linear 21）和钳形TFO在不同缓冲液条件下的结合效率。结果表明，在1 μM浓度下，Linear 15优于Linear 21；钳形TFO在所有缓冲液组合中表现一致。研究人员决定维持中性pH且不添加镁离子。进一步优化发现，在0.25 μM至1 μM浓度范围内，4小时和24小时孵育无显著差异，但0.13 μM浓度下杂交效率有降低趋势。值得注意的是，钳形TFO表现出完全结合效率，而线性TFO在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中可能发生解离。通过BQQ-OP切割实验验证，所有测试的TFO形式（Linear 15、Linear 15H、Linear 21和Clamp 15）均能有效形成三链体结构，而对照ON仅显示线性化条带。
不同形式Dynabeads的纯化效果：比较了三种链霉亲和素包被磁珠（MyOne C1、MyOne T1和M-280）的纯化效率，结果显示三种磁珠性能相当，后续实验使用MyOne C1磁珠。
不同TFO类型、浓度和杂交时间下的纯化效率评估：即使在4小时的短孵育时间内，MC产品中的杂质也显著去除，表明杂交过程具有快速动力学特性。然而，当TFO浓度降低至0.13 μM时，部分杂质残留，提示存在饱和效应。TFO浓度与杂交/纯化效率之间存在相关性，较高浓度可在较短时间内增强杂质去除效果。
PP杂质评估：在MC样品中额外加入高达4%的PP杂质后，纯化效率仍然保持稳健。在整个实验过程中，杂质评估的检测限保持在可接受范围内，证明了纯化过程的可靠性。
FXN表达MC显著增强FXN mRNA和蛋白表达：RT-qPCR结果显示，MC-FXN在0.8 μg、0.6 μg和0.4 μg剂量下分别实现了94倍、19倍和3倍的FXN mRNA表达增加（p值分别为<0.0001、=0.01和=0.01），而PP仅表现出适度的剂量依赖性增加，在0.8 μg PP时增加2.13倍。ELISA检测显示，MC-FXN转染细胞的FXN蛋白表达水平达到与健康对照相当的水平，而PP未诱导FXN蛋白表达。流式细胞术DAPI染色显示，与未处理对照相比，MC-FXN处理未检测到细胞毒性增加，但在较高剂量下观察到活力下降趋势，可能与PEI介导的转染应激有关。
单次DNase处理有效降解PP和MC：由于PP和MC均含有FXN编码序列，在RNA分离过程中消除残留DNA至关重要。单次DNase处理有效降解了残留的PP和MC，RT-qPCR结果显示单次与双重DNase处理无显著差异。PCR和凝胶电泳进一步验证了DNase处理后无残留PP和MC。Sanger测序确认FXN编码序列在两个载体中均完整，启动子区域未发现差异，支持观察到的表达差异并非由序列变异引起，而是与MC-FXN载体中细菌骨架序列缺失和尺寸减小相关。
流体力学尾静脉注射MC-FXN增强YG8JR小鼠肝脏和心脏FXN水平：YG8JR小鼠模型含有超过800个GAA•TTC重复序列的人FXN基因敲入，其肝脏和心脏FXN水平分别仅为对照Y47R小鼠的约3%和5%。通过流体力学尾静脉注射2.25 μg/g MC-FXN，72小时后ELISA定量显示，肝脏FXN蛋白水平较盐水对照组增加约18倍（p=0.0105），心脏组织FXN蛋白水平增加约3倍（p=0.0017），而肺组织中未检测到FXN蛋白水平增加。这表明MC-FXN递送主要局限于肝脏和心脏。
五、讨论与结论
本研究优化了TFO杂交和纯化程序，用于生产纯化的MC DNA载体。三种磁珠（MyOne C1、MyOne T1和M-280）在纯化效率上表现相当，磁珠类型的选择可能不会显著影响纯化效率。线性TFO通过Hoogsteen氢键结合靶序列，而钳形TFO由两个臂通过连接子连接，一个臂通过Hoogsteen碱基配对结合，另一个臂通过Watson-Crick碱基配对并入侵双链DNA，形成更稳定的结合。然而，在MC纯化条件下，线性TFO和钳形TFO在杂交和纯化效率上无显著差异，这可能是因为磁珠纯化条件不如细胞内环境剧烈。
TFO浓度与纯化效率之间的相关性强调了调整TFO浓度以稳健去除MC制备中杂质的重要性。即使在短杂交时间内也表现出快速纯化动力学，但较长的孵育时间可能有利于在较低TFO浓度下实现最佳纯化效率。在存在额外PP杂质的情况下仍观察到稳健的纯化效率，这对MC生产过程的可扩展性和可靠性具有积极意义。
MC载体以其安全性和持久基因表达为特征，代表了递送FXN等治疗基因的有吸引力的平台。MC生产需要高效的PP重组为MC和含骨架产物，随后去除残留PP、微型质粒/骨架DNA、基因组DNA、RNA、蛋白质和内毒素。尽管本研究结果支持三链体介导纯化在改善MC-FXN纯度和FXN激活方面的可行性，但规模化生产仍是MC治疗药物的重要挑战。需要进一步评估回收率、纯度、批次间重现性、内毒素去除和GMP兼容的质量控制标准，以确定当前三链体介导策略能否转化为更大规模的MC-FXN生产。
