CMT1A周围神经中胶质细胞的持续增殖与异质性：RUNX2施万细胞亚群及神经内膜成纤维细胞的病理参与

《Neurobiology of Disease》：Glia proliferation and heterogeneity in CMT1A: Involvement of RUNX2-Schwann cells and endoneurial fibroblasts

　　

腓骨肌萎缩症1A型（Charcot-Marie-Tooth type 1A, CMT1A）是一种由包含PMP22（peripheral myelin protein 22, 外周髓鞘蛋白22）基因区域的基因组重复引起的遗传性周围神经病变，通常在儿童期或青春期发病。患者常表现为步态异常、远端运动功能障碍以及特征性的传导速度均匀减慢；病理上以脱髓鞘、大直径有髓轴突丧失和显著的脂质代谢障碍为特征，并伴随涉及髓鞘、轴突、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）及多种细胞类型的广泛神经重塑。尽管CMT1A神经发育过程中已见显著的组织细胞增多（hypercellularity），但细胞增殖在成年阶段的持续性及其细胞来源长期存在争议。部分研究未发现该病存在增殖证据，或报道增殖仅限于洋葱球结构、巨噬细胞或早期发育阶段；另有体外研究提示PMP22过表达可能作为生长停滞信号，而啮齿类模型中的观察又仅限于出生后早期。为阐明这一问题，研究人员利用CMT1A大鼠模型，对2至12月龄野生型（wild-type, WT）和CMT1A坐骨神经进行时间序列分析，并结合bulk RNA测序、免疫荧光、Western blot及原代细胞培养等手段，系统解析CMT1A神经的增殖特征与细胞异质性。结果显示，CMT1A神经在成年期维持持续性细胞增殖，且增殖主要来源于施万细胞（Schwann cell, SC）谱系；转录组分析进一步揭示上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）转录程序的显著富集，并伴随RUNX2的持续性高表达，该转录因子近期被证实参与损伤介导的反应。此外，一种仅由神经内膜成纤维细胞（endoneurial fibroblast）分泌的ECM蛋白SMOC2在CMT1A坐骨神经中显著上调，提示CMT1A中成纤维细胞生理功能可能发生改变，并参与进行性神经组织重塑。

CMT1A是最常见的遗传性周围神经病变，由17p11.2区域包含PMP22基因的基因组串联重复引起，患者通常在儿童期或青少年期出现步态异常、远端肌肉无力和传导速度均匀减慢。病理组织学上，CMT1A神经呈现低髓鞘化、大直径有髓轴突进行性丧失，残余小直径轴突群体比例上升且g-ratio降低，整体结构类似未成熟的周围神经。除脱髓鞘外，CMT1A神经还经历涉及髓鞘、轴突、细胞外基质和多种细胞类型的广泛重塑。既往研究已注意到CMT1A神经发育期存在显著的组织细胞增多，细胞密度可达健康对照的十倍，可能源于洋葱球形成、低度炎症或SC谱系增殖。然而，成年期CMT1A神经的增殖是否持续、具体细胞来源及其分子机制长期存在争议：部分研究未检测到增殖，部分发现增殖伴凋亡增加，另一些则将其局限于洋葱球或巨噬细胞；体外实验提示PMP22过表达可能作为生长停滞信号抑制细胞周期，而啮齿类研究仅观察到出生后两个月内的增殖活性。因此，系统解析成年CMT1A神经的增殖动态、阐明驱动广泛组织重塑的细胞及分子机制，成为亟待解决的关键科学问题。为回答上述问题，研究人员利用K.-A. Nave实验室构建的CMT1A大鼠模型，对WT与CMT1A大鼠自2至12月龄的坐骨神经开展时间序列动态分析，同时覆盖P5至P30早期发育阶段。研究综合运用SYBR Green DNA绝对定量、全核区形态计量学、bulk RNA测序、多参数免疫荧光、Western blot及原代细胞分离培养，系统绘制了CMT1A神经在成年期的细胞增殖图谱、转录异质性图谱及细胞类型特异性分子特征。研究首次证实CMT1A神经的增殖活动可持续至12月龄，且主要来源于SC谱系；鉴定出RUNX2特异性标记的一个SC亚群；并揭示神经内膜成纤维细胞通过SMOC2上调参与病理重塑。这些发现为理解CMT1A的多细胞病理机制提供了新视角，并提出了包括靶向增殖、调控RUNX2及促进谱系特异性重编程在内的潜在治疗方向。

本研究样本队列来源于CMT1A大鼠模型及其WT同窝对照，年龄跨度从P5至P365，共涉及160只大鼠用于多数实验，其中64只用于DNA定量与核形态分析，18只（每组3只，2、6、12月龄）用于bulk RNA-seq，10只用于Western blot，4只用于原代细胞培养。关键技术方法包括：采用SYBR Green荧光法结合标准曲线对坐骨神经样本进行DNA绝对定量，以评估组织细胞负荷；通过DAPI全核染色与CellProfiler软件对约19,000个细胞核进行形态计量学分析，量化核面积、紧凑度、偏心率及直径等参数；利用TruSeq Stranded mRNA文库构建与NextSeq平台对2、6、12月龄坐骨神经进行bulk RNA测序，数据经STAR比对至rn6基因组，RSEM定量后通过edgeR进行差异表达分析，并采用MCP-counter法推断免疫细胞与细胞毒性评分，运用GSEA、clusterProfiler及ClueGO解析增殖、EMT、神经嵴及损伤相关通路；通过免疫组织化学检测MKI67、SOX10、RUNX2、JUN及SMOC2等蛋白表达与共定位；Western blot验证RUNX2与SMOC2的蛋白水平；并通过Thy-1免疫磁珠分选原代坐骨神经来源的施万细胞与神经内膜成纤维细胞，验证SMOC2的细胞类型特异性表达。

3.1. CMT1A nerves exhibit persistent cellular proliferation in adult rats
研究人员通过SYBR Green DNA定量发现，CMT1A坐骨神经的DNA含量自P20起显著高于WT，至P365时CMT1A相对WT增加约2.4倍，呈现近3倍的绝对增益。核形态计量学分析显示，CMT1A神经在成年后仍维持较高核密度，且大核亚群持续存在，这一特征通常与活跃增殖相关。12月龄时，CMT1A坐骨神经中MKI67⁺细胞核数量较WT增加约6倍，每平方毫米面积内MKI67⁺细胞数显著升高。进一步分析显示，约90%的MKI67⁺细胞同时表达SOX10，明确成年期持续增殖主要来源于SC谱系而非浸润的免疫细胞。bulk RNA-seq的主成分分析表明，基因型差异在12月龄时最为显著，差异表达基因数量随年龄增长而增加。增殖相关基因如Mki67、Top2a、Aurkb和Cenpa在CMT1A神经中持续高表达，且其表达模式虽随年龄下降，但在所有时间点均高于WT，进一步支持持续性增殖的激活状态。

3.2. Cell-Type Signature Enrichment Reveals Immature and Mesenchymal-Like Transcriptional Programs in CMT1A Nerves
利用MCP-counter方法对bulk RNA-seq数据进行去卷积分析，研究人员未发现免疫细胞或细胞毒性评分在基因型与年龄间存在显著交互作用，排除了进行性免疫细胞浸润是细胞增多的主因。细胞类型特征富集分析显示，CMT1A神经显著富集胎儿SC、SC前体细胞、胎儿间充质及上皮-间充质转化（EMT）样转录特征。与胚胎发育相关的神经嵴细胞基因集上调，提示SC保留了向神经和间充质双向分化的潜能。相反，CMT1A神经中脂质、胆固醇和类固醇合成通路显著下调，这些通路是成熟SC髓鞘维持所必需的代谢程序。对12月龄差异最显著的前70个上调基因进行GO分析，发现钙离子隔离、ERBB信号通路及胚胎颅骨形态发生等生物学类别显著富集，进一步证实未成熟和间充质样转录程序在CMT1A神经中的系统性激活。

3.3. Emergence of RUNX2-Positive Schwann Cells and Altered JUN Associated Injury Responses in CMT1A Nerves
研究人员首先通过Western blot证实RUNX2在12月龄CMT1A坐骨神经中的蛋白水平显著上调。免疫荧光双标显示，RUNX2⁺细胞与SOX10⁺细胞在WT和CMT1A神经中完全共定位，表明RUNX2表达严格限于SC谱系。CMT1A神经中RUNX2⁺细胞比例和密度均显著高于WT，12月龄时RUNX2⁺细胞占核总数的比例约为2.93%。鉴于RUNX2在神经损伤反应中的作用，研究人员进一步检测了SC损伤重编程的关键调控因子JUN。JUN的转录和蛋白水平在CMT1A坐骨神经中均显著升高。SOX10与JUN双标分析发现，SOX10⁺JUN⁺细胞（即经典Büngner细胞）在CMT1A神经中几乎 exclusively 出现，且SOX10⁺JUN^-与SOX10^-JUN^-群体也显著增加。GSEA分析揭示，CMT1A神经中损伤反应相关基因集显著富集；然而，在JUN敲除小鼠损伤神经中上调的基因集同样在CMT1A中富集，提示CMT1A存在一种异常激活但转录失调的损伤样反应。此外，在SOX10^-细胞群中，研究人员发现成纤维细胞特异性标志物SMOC2在CMT1A神经中显著上调。原代细胞免疫荧光证实SMOC2仅表达于纯化的神经内膜成纤维细胞，而在SC中不表达，首次提示CMT1A中存在成纤维细胞特异的转录程序激活。

4.1. Chronic Proliferative State Underlies CMT1A Neuropathy
讨论部分强调，本研究首次报道CMT1A神经的增殖活动可持续至12月龄，远超经典发育窗口。增殖在P20前即已启动，成年后虽生理性下降但仍异常升高。有限比例的快速循环细胞（约3%）可能代表具有缓慢循环特征的组织干/祖细胞群体，这种特性使细胞能够在受控的谱系扩展过程中维持基因组稳定性和长期多能性。通过整合RNA-seq与免疫表型分析，研究明确排除了洋葱球相关多余SC和驻留巨噬细胞对整体细胞增多的主要贡献，证实增殖几乎 exclusively 源于SC谱系。鉴于多种遗传性和中毒性周围神经病均存在SC周期失调，靶向SC增殖可能代表跨亚型的共同治疗策略。

4.2. RUNX2-linked schwann cell injury programs and fibroblast-driven remodeling in CMT1A
讨论进一步指出，RUNX2在CMT1A中标记一个独特的SC亚群，其比例远低于JUN⁺群体，提示RUNX2⁺ SC可能是区别于经典Büngner细胞的修复亚群，并在时间或空间动力学上与JUN存在部分独立的功能关系。近期研究表明RUNX2⁺细胞数量随衰老增加，而清除这些细胞可部分恢复损伤后的再生能力，提示该群体在CMT1A中的持续存在可能代表一种损害修复的不适应性损伤反应。关于神经内膜成纤维细胞，研究指出SMOC2的选择性上调提示该细胞类型通过ECM重塑和钙离子稳态改变参与病理过程。CMT1A患者来源iPSC模型也显示SC向CD34⁺成纤维细胞样细胞分化偏移，进一步支持发育可塑性的增加和细胞间动态互作的重要性。尽管PMP22重复与RUNX2表达之间的直接分子联系尚未完全阐明，但CMT1A可能通过一种广泛的不良适应性损伤反应和SC分化缺陷驱动多细胞重塑，这一机制可能与其他CMT亚型共享。

综上所述，研究人员证实CMT1A周围神经在整个成年期维持持续性细胞增殖，该过程主要由施万细胞谱系驱动，并伴随显著的未成熟、间充质样及损伤易感性转录程序。RUNX2标记了一个区别于经典Büngner细胞的独特施万细胞亚群，而神经内膜成纤维细胞通过SMOC2上调参与进行性神经组织重塑。这些发现揭示了CMT1A病理机制中多细胞协同作用的新模式，并提出靶向抑制细胞增殖、调控RUNX2活性或促进谱系特异性转录重编程可能为这一疾病提供新的干预策略。