《Chemistry – A European Journal》：Multimodal Imaging of Live Cells and Tumor Spheroids by a G-Quadruplex DNA Selective Ru(II)Polypyridyl Probe
编辑推荐：
G-四链体（G-quadruplex, G4）DNA结构正成为多种疾病状态中新兴的治疗靶点。因此，需要高选择性的小分子发光探针来监测活细胞中G4的丰度、动态变化及治疗响应。尽管钌配合物作为溶液中的DNA和G4多模态探针已被广泛探索，但能够在活细胞内发挥功能的G
G-四链体（G-quadruplex, G4）DNA结构正成为多种疾病状态中新兴的治疗靶点。因此，需要高选择性的小分子发光探针来监测活细胞中G4的丰度、动态变化及治疗响应。尽管钌配合物作为溶液中的DNA和G4多模态探针已被广泛探索，但能够在活细胞内发挥功能的G4选择性钌探针仍然难以实现。本文报道了一种G4选择性、发光的“光开关”钌(II)配合物Ru-PDC3在细胞内的选择性探针应用。虽然Ru-PDC3此前已知能以高亲和力结合G4并诱导溶液相结构去稳定化，但研究人员证明该配合物优先定位于活体HeLa细胞的细胞核内，从而实现对G4结构的动态追踪。通过磷光寿命成像显微镜（phosphorescence lifetime imaging microscopy, PLIM）、拉曼图谱（Raman mapping）、酶消化以及与G4特异性抗体BG4的共定位研究，确认了该配合物在细胞内的G4选择性结合。此外，提高配合物浓度或超出标准成像条件的可见光照射强度可诱导光毒性。机制研究采用细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）清除剂和质粒DNA切割实验，证实光毒性源自单线态氧的产生，并伴有自由基物种的贡献。综上所述，这些发现确立了Ru-PDC3作为一种强大的双功能工具，既可实现G4-DNA的实时可视化，又可用于潜在的光动力靶向治疗。
论文解读文章
一、研究背景与研究目的
G-四链体（G-quadruplex, G4）是一类非经典DNA结构，由富含鸟嘌呤的核酸序列折叠形成，由四层堆叠的鸟嘌呤四分体通过中心金属离子（通常为K?）配位及四分体间氢键稳定。越来越多的证据表明G4在DNA复制、基因表达、mRNA定位和基因组维持中发挥重要作用，因此G4成为癌症、衰老和神经系统疾病等多种病理状态药物研发中的新兴靶点。在癌症治疗策略中，端粒及关键癌基因启动子区域已鉴定出G4形成序列，G4结构的稳定或去稳定可影响疾病进展。G4稳定剂可通过诱导端粒DNA形成G4来抑制端粒酶活性，阻止端粒延伸，进而导致癌细胞衰老或凋亡；某些G4配体还可通过类似拓扑异构酶II毒化的机制诱导DNA双链断裂。相比之下，G4去稳定剂的开发相对滞后，仅有少数化合物主要在体外得到研究，在细胞中评估的更少。G4去稳定剂可能有助于维持细胞基因组稳定性、抵消G4稳定的效应，并提供G4机制性见解。
尽管体外和分子生物学研究在阐明G4配体对核酸及相关分子通路的生物学和生化效应方面发挥了重要作用，但这些研究往往难以捕捉活细胞中的动态时空过程。因此，研究重点日益转向利用发光配体在细胞内可视化G4，其中最为人熟知的是标记抗体配体如BG4。然而，在活细胞中成像G4面临诸多挑战，包括G4的结构多样性、动态特性以及探针需要在结构相似的DNA背景下具备选择性。这些挑战催生了对高选择性结合剂和多模态成像方法的强烈需求，以整合发光成像与拉曼光谱等手段，从而获得探针-G4相互作用的分子水平见解。
钌(II)配合物，特别是含有dppz（dipyrido[3,2-a:2′,3′-c]phenazine）或相关配体的配合物，因其“光开关”特性而备受关注——可通过发光开启来报告DNA结合。尽管多种钌配合物在溶液中对G4结构表现出高亲和力和区分能力，但由于其同时倾向于结合双链DNA，迄今尚未有钌(II)成像探针具备足够的细胞内核G4选择性成像能力。
研究人员此前报道了G4选择性配合物[Ru(phen)?(tpphz-PDC3)]??（Ru-PDC3）的制备，该配合物将dppz配体的“开关-on”发射特性与公认的G4选择性配体Phen-DC3结合于单一结构中。溶液研究证实了Ru-PDC3的选择性G4结合亲和力，该配合物在乙腈中于蓝光激发下在645 nm处发射且具有水溶性。Ru-PDC3表现出不寻常的G4去稳定化特性，在圆二色光谱中表现为G4椭圆度显著丧失，对人KRAS癌基因启动子序列形成的平行结构G4及凝血酶结合适配体TBA形成的反平行G4效应最为显著。在A549肺癌上皮细胞中的初步研究表明，该配合物通过能量依赖过程被摄取，主要定位于内体和溶酶体，表明在该细胞系中发生内体捕获。与其他已报道的钌G4结合剂不同，该配合物在双链DNA结合时发射相对较弱，而G4结合则产生明亮、长寿命的发射。
本研究旨在证明Ru-PDC3通过在单一化学结构中整合互补的成像模态，为活细胞G4研究提供独特优势。其“光开关”特性可实现常规共聚焦荧光显微镜和寿命成像，用于HeLa细胞中G4富集区域的空间图谱绘制。研究人员评估了该配合物在两种癌细胞系和肿瘤球体中的摄取、毒性及光毒性，并研究了光毒性机制及Ru-PDC3在细胞内去稳定G4组装的能力。
二、主要技术方法概述
本研究采用多种互补的成像和生化技术。共聚焦荧光显微镜用于活细胞和肿瘤球体中Ru-PDC3的空间分布成像；磷光寿命成像显微镜（PLIM）用于区分不同结合状态的发射寿命特征；共振拉曼光谱（resonance Raman spectroscopy）利用配合物的大斯托克斯位移实现细胞内分子级分布图谱及G4结合的结构证据；免疫荧光共染色采用G4特异性抗体BG4验证核内G4结合；酶消化实验（RNase A和DNase I）用于确认核酸依赖性；细胞活力测定（IC??）和光照射实验评估暗毒性和光毒性；活性氧清除剂实验和质粒DNA切割实验用于阐明光毒性机制；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析用于验证G4去稳定化效应。细胞系包括HeLa、MCF7和A549，另使用HeLa肿瘤球体模型。
三、研究结果
3.1 MCF7和HeLa细胞中的细胞摄取
与此前在A549细胞中的初步报告相反，Ru-PDC3在MCF7和HeLa细胞系中可渗透进入细胞核。在HeLa细胞中，配合物表现出依赖于细胞融合度的染色模式：高融合度细胞中，点状发射局限于细胞核和核周区域；低融合度时，核内弥散性积累增加，包括核仁结构的明亮发射。PLIM成像显示核内发射衰减拟合为三指数模型，其中长寿命组分（τ? = 446 ± 10 ns）与Ru-PDC3在溶液中结合G4时的寿命（如22AG为426 ± 8 ns）高度一致，显著长于双链DNA结合时的约280 ns寿命，表明核内长寿命组分源于G4结合。
3.2 与BG4的免疫荧光共染色研究
Ru-PDC3与G4特异性抗体BG4表现出共定位（Pearson系数r = 0.55 ± 0.02），强度线剖面显示BG4和Ru-PDC3信号的空间重叠。RNase A消化后核仁发射强度降低，提示核仁区域有RNA贡献；而DNase I处理后点状发射显著丧失，支持核内点状Ru-PDC3信号主要与DNA结构相关。固定细胞中先以BG4标记再孵育Ru-PDC3时，BG4干扰Ru-PDC3与G4结构的结合；先孵育Ru-PDC3再标记BG4时，BG4标记效率降低，可能源于Ru-PDC3对G4结构的去稳定化。
3.3 拉曼显微镜
共振拉曼光谱确认了Ru-PDC3在细胞核内的积累，与共聚焦显微镜结果一致。细胞质中Ru-PDC3浓度较低，表明该区域缺乏发射并非由于“光开关”淬灭而是配合物实际不存在。溶液研究中，1540 cm?1振动模式（归属于吩嗪部分）在G4结合时消失但在双链DNA结合时保留，该特征在细胞核拉曼光谱中同样缺失，提供了G4结合的分子级证据。时间序列成像显示点状染色在短时间内强度和分布均发生波动，表明核内G4的持续形成或解离。
3.4 细胞活力和光照射研究
Ru-PDC3在无光照条件下对MCF7细胞（IC?? > 100 μM）和HeLa细胞（IC?? = 70 ± 3.21 μM）均表现出一定暗毒性。光照后光毒性显著增强：HeLa细胞光照射因子（PIF）为37.84，MCF7细胞PIF > 28，且照射剂量仅2.96 ± 0.02 J/cm2，表明强光毒性。光毒性呈剂量依赖和光强度依赖。机制研究证实Ru-PDC3在光照下产生单线态氧，DPBF降解实验显示几乎完全降解；DNA切割实验表明该配合物在光照下诱导超螺旋DNA松弛和线性化，NaN?（单线态氧清除剂）显著抑制切割活性，而DMSO（自由基清除剂）仅部分影响，表明光毒性涉及I型和II型光反应。
3.5 多细胞球体中的摄取和行为
在HeLa肿瘤球体中，Ru-PDC3的穿透深度呈浓度依赖性：10 μM孵育24 h可渗透至球体核心，而70 μM主要局限于外层。球体中配合物表现出较高的暗毒性（IC?? = 14.04 ± 2.12 μM），PIF仅为1.35。ROS指示剂染色显示无光照条件下球体内即存在高浓度ROS。PLIM显示球体中外层和中心细胞层的发射寿命均为双指数且缺乏G4结合的长寿命组分，表明球体中配合物未与G4结合，发射可能源于疏水膜区域。PAGE分析证实Ru-PDC3以浓度依赖方式使KRAS和htel21T18 G4结构条带消失，验证了其G4去稳定化能力。
四、结论与意义
Ru-PDC3将钌dppz的“光开关”能力与Phen-DC3的强G4亲和力结合于单一结构中，在到达细胞核时能够在活细胞中实现G4结构的定位和动态追踪。该配合物在HeLa细胞中显示核摄取和点状核仁染色，在MCF7细胞中主要积累于线粒体，而在A549细胞中被内体捕获，表现出细胞类型依赖的分布差异。通过共聚焦显微镜、PLIM和共振拉曼三种互补成像模态，研究人员确认了HeLa细胞核内点状染色源于G4结合。在成像浓度下配合物毒性较低，但较高浓度和光照可诱导由ROS介导的强光毒性（HeLa细胞PIF = 37.84）。在肿瘤球体中，配合物表现出浓度依赖的组织穿透性和高暗毒性。Ru-PDC3结合了G4相互作用、细胞依赖性定位和光毒性特性，为G4光去稳定剂的未来研究提供了有前景的探针工具，可能为精准、微创的癌症诊断和治疗提供新策略。鉴于核靶向的细胞系依赖性，未来研究将致力于实现跨细胞系的可靠核靶向。
