《Exploration》：Harnessing Extracellular Vesicles for Precision Diagnostics and Infectious Disease Management: Integrating Host- and Pathogen-Derived Cues
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传统的传染病诊断通常依赖于检测病原体衍生因子或针对这些因子的免疫反应来诊断疾病。然而，这些方法可能缺乏区分活动性感染与潜伏性感染、或致病性感染与非致病性定植事件的特异性。细胞外囊泡——一种纳米级囊泡，由大多数细胞大量分泌，尤其是在应对疾病和细胞损伤时——可以携
传统的传染病诊断通常依赖于检测病原体衍生因子或针对这些因子的免疫反应来诊断疾病。然而，这些方法可能缺乏区分活动性感染与潜伏性感染、或致病性感染与非致病性定植事件的特异性。细胞外囊泡——一种纳米级囊泡，由大多数细胞大量分泌，尤其是在应对疾病和细胞损伤时——可以携带指示病原体存在及其毒力状态的病原体特异性因子，以及免疫和炎症反应信号。同时携带这两类因子的EVs因此能够提供关于疑似感染者体内微生物的存在、身份和致病表型的宝贵信息。评估存在于唾液、尿液、血液及其他可获取生物体液中的、同时包含宿主和病原体信息的EVs（hpEVs），有助于疾病的检测、分层和监测。本综述讨论了EVs与感染的相关性，并重点介绍了可用于分析hpEVs以促进未来临床应用的方法，包括新的信号放大策略、单囊泡分辨率分析方法、微流控平台以及基于人工智能的数据分析方法。本文还讨论了为实现hpEV应用在疾病诊断和管理中的开发与推广所必须解决的关键挑战。
论文主体内容总结
1 引言
传染病仍然是发病率和死亡率的主要原因，这是由于几种主要人类病原体的持续存在以及新兴人畜共患病原体可能导致重大疾病暴发。快速灵敏的诊断策略至关重要，因为传统诊断方法（如培养、抗原和核酸检测）往往灵敏度或特异性低，需要侵入性样本，或对基础设施有要求，限制了其在某些环境中的效用。新诊断方法还应理想地检测潜伏性、无症状或细胞内感染，特别是在其早期阶段或病原体载量较低的情况下。病原体衍生因子可用于检测特定病原体，有时还能提供其毒力信息。然而，人们越来越关注并行检测宿主衍生生物标志物，这些标志物可以检测活跃的免疫反应，从而帮助区分活动性感染与潜伏性感染或定植，以及对特定治疗方案的反应。细胞外囊泡（EVs），即由脂质双层包裹的纳米结构，在疾病及相关细胞损伤过程中被宿主细胞大量分泌，在其脂质双层或腔内携带可调节这些过程的病原体和宿主衍生因子。这些EV生物分子货物反映了其起源细胞的表型，并能提供关于影响它们的病原体的存在、身份和行为的有价值信息。因此，EVs已成为检测和监测特定传染病进展及治疗反应的新型生物标志物的高度信息源。此外，由于EVs能轻易穿过大多数生物屏障并在大多数生物体液中积累，包括血液、尿液和唾液，这使得可以使用非侵入性或微创标本进行分析，便于重复分析以进行治疗监测和疾病管理。值得注意的是，EVs还携带并保存了在大多数生物体液中会迅速降解的生物分子，从而可以通过一系列先进的分析方法对其进行灵敏和可重复的检测。宿主细胞和细胞病原体都能分泌EVs以影响疾病的发展和进程。感染期间积累的宿主源性EVs（hEVs）可源自多种细胞类型，包括受病原体感染的宿主细胞、感染部位邻近但未感染的细胞以及被招募到该部位的免疫细胞。这些EVs可能由于存在病原体衍生因子，或由于受感染病原体或宿主对该病原体的局部或全身反应直接调控的宿主衍生因子表达发生变化，而表现出独特的病原体相关组成变化。因此，感染期间宿主细胞分泌的EVs可分为两类：由受感染细胞或与受感染细胞相互作用的细胞释放的EVs，它们同时含有宿主源性和病原体源性因子（hpEVs）；以及由未感染细胞或不与之显著相互作用的细胞分泌的EVs，它们只含有宿主源性因子而不含病原体源性因子（hEVs）。最后，细胞病原体也可以直接分泌病原体源性EVs（pEVs），将因子转移到邻近和远处的细胞，以改变其微环境和宿主免疫反应。由响应感染而分泌的hEVs、hpEVs和pEVs所调控的复杂的双向宿主-病原体相互作用，可以影响调节免疫反应、炎症、毒力和疾病进展的关键过程。过去十年中，多组学分析、单囊泡分析和超高灵敏度检测平台的进展揭示了病原体暴露后EV介导的对免疫、致病和恢复反应的特定效应。基于这些发现，本综述在概念上将感染相关的细胞外囊泡独特地划分为三个不同的亚群：hEVs、pEVs和hpEVs。与以往侧重于EVs的综述不同，这种框架允许更清晰地区分感染期间EVs携带的多样化生物学信息。值得注意的是，hpEVs整合了病原体衍生组分和宿主反应信号，构成了一个高度信息化的生物标志物来源，为了解宿主-病原体相互作用以及能够调节受体细胞行为的EV相关因子提供了见解。一些新兴技术也促进了hpEV群体的灵敏检测和高分辨率分析，包括新的信号放大技术、单囊泡分辨率方法和人工智能介导的数据分析方法。总的来说，这些工具正在通过支持开发新的灵敏高通量方法来诊断和评估特定传染病，从而加速EV研究从实验室到临床的转化。
2 EVs调控控制疾病发病机制的过程
EVs介导病原体与宿主免疫系统之间的关键相互作用，因为hEVs和pEVs可以协同重塑免疫微环境，在疾病的发生和发展中发挥重要作用。宿主源性EVs反映了宿主的生理和免疫状态，包括炎症、组织损伤和免疫激活。另一方面，病原体源性EVs携带感染原的分子特征，如病原体特异性核酸或蛋白质，提供了病原体存在和毒力的直接证据。同时分析hpEV群体中的宿主和病原体衍生组分，可以提供更全面的宿主-病原体相互作用视图，从而提高诊断灵敏度，实现更好的疾病分层，并可能为靶向治疗策略提供信息。本节讨论了在选定传染病的发展与发病机制中，宿主和病原体源性EV组分的互补作用，以及源自hEVs和pEVs数据的应用。
2.1 pEVs因子对疾病发病机制和宿主反应的影响
引起人类疾病的细菌、真菌和寄生虫可以分泌EVs来影响宿主对感染的反应，一些病毒也被报道劫持EV生物发生途径来产生pEVs。尽管来源和生物发生模式多样，但来自各种病原体的pEVs已被证明可以通过将病原体相关分子递送到宿主免疫或上皮细胞中来调节宿主先天性和适应性免疫。这些分子货物可以改变细胞内信号通路，抑制抗原呈递，减弱促炎反应，或促进免疫许可环境，以利于逃避宿主免疫反应并促进感染和疾病进展。本节总结了来自不同类型病原体的pEVs的主要效应。
2.1.1 细菌源性EVs
细菌通过多种途径产生pEVs以调节宿主反应并增强细菌存活、传播和慢性感染状态。革兰氏阳性和阴性细菌都释放膜囊泡（MVs），但只有革兰氏阴性菌释放外膜囊泡（OMVs）。MVs和OMVs表现出不同的分子组成和功能特性。例如，结核分枝杆菌的MVs富含脂阿拉伯甘露聚糖（LAM），这是一种损害巨噬细胞功能的糖脂；而肠出血性大肠杆菌O157的OMVs可通过其相关毒力因子强烈诱导肠上皮细胞促炎反应。环境压力也会改变这些囊泡的生物发生和组成。
2.1.2 真菌源性EVs
致病性真菌如新型隐球菌、白色念珠菌和烟曲霉也会释放装载有多种免疫调节因子货物的pEVs，这些因子有助于免疫逃逸和真菌持久性。例如，白色念珠菌pEVs将真菌DNA递送至巨噬细胞胞质溶胶，激活cGAS-STING通路，诱导I型干扰素反应。这些发现表明真菌pEVs可以调节先天免疫。
2.1.3 病毒相关EVs
虽然病毒本身不分泌EVs，但一些病毒进化出了复杂的方法来劫持宿主细胞的内体、多囊泡体和自噬途径，使其释放可作为特洛伊木马的囊泡，通过将病毒成分隐藏在宿主衍生的脂质双层内来削弱免疫并促进病毒传播。无包膜病毒和有包膜病毒都可以利用宿主EV生物发生机制包装病毒颗粒、基因组物质或其他因子以逃避免疫检测或改变病毒导向的免疫反应。病毒介导的EV组成变化可以影响病毒传播、复制和持续性等一系列宿主过程。
2.1.4 寄生虫源性EVs
原生动物寄生虫和蠕虫进化出了利用其EVs改变细胞反应以促进持续感染的复杂策略。例如，寄生性蠕虫多形螺旋线虫分泌的EVs将小RNA转移到宿主细胞中以调节宿主免疫通路；布氏锥虫释放的EVs在调节宿主-寄生虫相互作用和免疫反应中发挥关键作用。寄生虫源性EVs是强大的功能性介质，可以调节广泛的疾病相关宿主过程。
2.2 病原体源性EVs在疾病诊断和评估中的应用
病原体源性EVs可以包含识别特定感染病原体及其生存能力的因子。pEVs作为新型诊断和预后应用的生物标志物来源具有相当大的前景。然而，采用pEV生物标志物的应用必须将这些EVs与多样的hEV群体和其他非囊泡组分区分开来，后者在诊断样本中通常更为丰富。可能需要选择性富集这些pEVs以防止其信号被背景掩盖。pEV生物标志物的分析可能需要从样本的一般EV群体中分离出这些EVs，或使用能够直接区分这些特定pEV生物标志物与其他更丰富的EVs贡献的因子的分析方法。已经探索了几种用于选择性富集或检测复杂样本中pEVs的方法，包括使用亲和富集方法，例如针对LPS的分子印迹聚合物或抗生素偶联探针。
2.3 宿主源性EVs对疾病发病机制和宿主反应的影响
hEVs的几个特性使其成为疾病诊断、预后和治疗评估的生物标志物特别有价值的来源。感染细胞和受感染影响的细胞衍生的EVs在各种生物样本中通常比pEVs丰富得多；可以很容易地通过非侵入性或微创程序获得；并且可以提供患者对感染病理反应的全面快照。宿主源性EVs可以携带反映感染后诱导的局部和全身反应的因子，包括那些可以调节病原体诱导的免疫和促炎反应以及组织损伤和重塑通路的因子。这些EVs可以广泛分为直接来源于细胞内病原体感染的细胞的EVs，以及由病原体或其宿主细胞释放的因子影响的细胞分泌的EVs。
2.3.1 非感染细胞分泌的EVs
未感染的免疫细胞可以主动分泌EVs，在协调对感染的局部和全身免疫反应中发挥关键作用，因为它们可以携带一系列具有免疫活性的因子。中性粒细胞衍生的EVs通常含有抗菌肽和酶，有助于清除病原体并调节相邻细胞行为。非免疫细胞，包括上皮细胞、内皮细胞和基质细胞，也可以在响应病原体暴露或炎症刺激时分泌EVs。此外，免疫和非免疫细胞分泌的EVs经常含有作为病原体和损伤相关分子模式的因子、识别这些模式的模式识别受体、促炎细胞因子等。宿主源性EVs还可以充当“分子海绵”，结合并隔离病原体衍生的毒力因子以减轻其进展和发病机制。
2.3.2 感染细胞分泌的EVs
感染了细胞内病原体的细胞在其分泌行为上，特别是EV分泌方面，可能表现出深刻的变化。受感染的免疫和非免疫细胞都可以释放富含免疫调节因子的EVs。这类hpEVs可以与各种细胞群相互作用，以调节免疫监视、促进或抑制炎症、影响免疫逃逸或加剧组织病变。受感染细胞分泌的EVs可以提供关于病原体表型以及受感染细胞的大量信息，这对于评估感染状态、预测疾病严重程度以及评估或预测治疗结果可能有用。
2.4 宿主源性EV亚群在疾病诊断和评估中的应用
2.4.1 hEV生物标志物在评估疾病严重程度和治疗反应中的应用
越来越多的证据支持使用hEVs作为传染病诊断和预后的生物标志物，因为它们携带的分子特征可以高灵敏度地检测感染并评估其严重程度。例如，脓毒症患者EV miR-483-3p和let-7d-3p水平的纵向监测已显示与其临床指标强相关。特定的血浆EV miRNA谱也已显示出能够区分发展为急性呼吸窘迫综合征的脓毒症患者和未进展的患者。血清中富集特定表面标志物的EVs也已被证明与COVID-19疾病的严重程度相关。
2.4.2 hpEVs在疾病诊断和预后中的应用
受感染细胞分泌的EVs可以携带源自宿主细胞及其病原体的分子特征，这在用于疾病诊断和预后时具有强大优势。几种细胞内病原体已进化出改变其宿主EV生物发生的机制，以确保其基因组物质、mRNA、蛋白质或毒力因子被选择性地包装到这些受感染细胞分泌的EVs中。这种选择性富集可以增强病原体特异性标志物在宿主背景下的检测，从而允许在早期感染或临床表现复杂的病例中进行更灵敏的疾病诊断。受感染细胞分泌的EVs还可以携带宿主衍生分子，提供关于宿主生物体促炎、免疫和组织损伤反应状态的有用信息。对宿主和病原体衍生生物标志物的综合分析可以提供关于感染及其相关免疫反应之间相互作用的重要信息，这对于预后评估和治疗决策通常至关重要。
3 用于基于hpEV诊断的新兴和现有方法
病原体感染的宿主细胞分泌的EVs为微创传染病诊断提供了有希望的宿主和病原体衍生生物标志物来源。然而，诊断性EV亚群的异质性和低丰度带来了技术挑战，促使需要专门的工具和整合分析策略。本节总结了基于hpEV诊断的新兴分析策略及其技术和转化意义。
3.1 对基于hpEV诊断的需求
由于大多数诊断样本类型中EV群体和组成的复杂性，可能需要多方面的诊断策略来分析hpEV生物标志物特征。生物标志物发现研究经常使用蛋白质组学和核酸分析方法来鉴定能够区分hpEVs与其他hEV群体以及特定疾病阶段和表型的宿主和病原体衍生因子。然而，这些方法不适用于诊断应用中的常规使用。以下小节描述了用于检测疾病相关EV核酸和蛋白质生物标志物的几种关键分析方法，以及如何整合这些方法可以改进诊断应用。
3.1.1 检测hpEV相关蛋白的方法
蛋白质组学为系统分析hpEVs相关蛋白提供了有力手段，有助于从多种样本类型中发现疾病相关生物标志物。例如，可以通过超滤等高通量EV富集技术从非侵入性患者尿液样本的总EV群体中分离EVs，并通过质谱分析提供EV蛋白和脂质组成的无偏图谱。这可以同时检测病原体和宿主衍生因子。应评估蛋白质组学分析是否鉴定的蛋白质来自EV膜或腔，因为这决定了哪些蛋白质靶点可以被特定方法检测到。此类表面生物标志物的识别可以通过多种技术确定，包括微珠捕获EV流式细胞术、EV ELISA方法和蛋白质微阵列。例如，一项研究使用暗场显微镜分析结合纳米颗粒增强免疫测定法检测循环EVs上的结核分枝杆菌毒力因子LAM及其载体蛋白LprG，能够区分活动性和潜伏性结核病病例。另一项研究通过在结合这些EVs的纳米颗粒偶联抗体上生成单晶铜壳，实现了70倍的信号强度增加和20倍的检测限改善。
3.1.2 检测hpEV相关核酸的方法
EVs还携带核酸，主要是RNA和少量DNA，可以提供关于特定宿主或病原体表型的非常有用的信息。然而，其分析的简便性受到其位于EV脂质双层后面的限制。EV核酸分析方法通常需要破坏EV脂质双层。一些研究使用设计用于穿透EV膜的分子信标探针进行原位核酸检测，但效率欠佳。然而，已有报告称脂质体-EV融合可以实现血浆源性EVs中病毒RNA的灵敏原位检测。
3.1.3 同时检测hpEV蛋白和RNA生物标志物的方法
EV分析方法传统上侧重于蛋白质或核酸靶点，因此无法评估特定EV群体或单个EVs内这些生物分子之间的复杂相互作用。同时分析蛋白质和RNA可以增强传染病诊断应用的灵敏度、特异性、分辨率和诊断及预后准确性。一种有前途的高通量方法采用单粒子干涉反射成像结合单分子荧光原位杂交。这种方法可以在单个EVs中同时检测和定量特定蛋白质和RNA靶点，例如用于区分源自活动性和潜伏性HIV-1感染细胞的传染性和非传染性EVs。
3.2 具有基于hpEV疾病诊断潜力的新技术
当前EV分析方法的灵敏度和特异性是基于hpEV诊断的主要限制，因为hpEV生物标志物可能难以在临床样本中其他更丰富的EV生物标志物群体的强而复杂的背景下被检测到。新的EV分析方法采用信号放大策略、单囊泡分辨率分析、集成微流控系统和人工智能驱动的方法来提供增强的灵敏度、分辨率和多重分析能力。许多这些技术最初是为其他生物医学应用开发的，但在疾病诊断方面显示出巨大潜力，特别是对于同时分析单个EVs内宿主和病原体生物标志物特征的多重应用。将先进的EV分析与标准化的EV分离方案和经过临床验证的工作流程相结合，将是释放基于EV的应用在疾病诊断和治疗评估方面全部潜力的关键。
