基于TransPillar培养平台实现人源气道类器官可重复标准化构建

《Small Structures》：TransPillar-Based Culture Platform for Reproducible and Standardized Formation of Human-Derived Airway Organoids

本研究提出了一种利用新开发的TransPillar平台实现人源气道类器官（airway organoids）标准化培养的优化策略。人气道组织由维持顶端–基底极性（apical–basal polarity）的基底细胞（basal cells）、杯状细胞（goblet cells）和纤毛细胞（ciliated cells）组成，气道类器官可重现该细胞组成以模拟原生组织。类器官标准化对于在降低尺寸变异性的同时保持细胞组成、极性和检测可靠性至关重要。然而，传统的FlatWell平台存在固有局限，重力驱动的细胞与细胞外基质（extracellular matrix）向下重新分布导致其在培养板界面处聚集，进而造成Matrigel dome内的结构异质性。相比之下，TransPillar平台将Matrigel dome维持于支柱下方的倒置构型，使重力驱动的细胞向dome远端重新分布。类器官优先在该区域形成且不黏附于刚性基底，从而降低生长异质性并改善结构均一性。免疫组织化学（immunohistochemical, IHC）分析证实存在维持顶端–基底极性的基底细胞、杯状细胞和纤毛细胞。与FlatWell培养相比，TransPillar展现出更高的回收效率并维持结构完整性，便于可靠的组织学评估。这些发现确立了TransPillar作为标准化气道类器官培养稳健平台的地位，为提升类器官研究的可重复性提供了一种简便而有效的策略。

**研究背景与问题**　人气道组织为假复层上皮结构，由基底细胞、杯状细胞和纤毛细胞等多种细胞类型组成，并维持明显的顶端–基底极性，其中顶端表面覆盖黏液并由运动纤毛排列，基底表面附着于基底膜，发挥组织修复、促炎反应及对外界环境屏障等生理作用。三维（3D）人源气道类器官可重现原生气道组织的结构与细胞复杂性，包括顶端–基底极性和多种细胞类型，因而日益被用作模拟多种呼吸系统疾病的体外模型。为确保从呼吸系统疾病建模到毒性检测与治疗评价等应用的可重复性，建立标准化的人源气道类器官培养至关重要。然而，传统FlatWell平台中气道上皮细胞–Matrigel混合物直接加载于板表面，dome形成高度依赖操作者技能；即使接种相同体积，沿板底的铺展差异也常导致dome高度不一致，产生dome间异质性。此外，单个dome内周边与中央区域类器官常出现尺寸差异，降低整体均一性。由于dome由平坦基底支撑，重力诱导细胞–基质混合物向下迁移和侧向位移，进一步加剧dome高度变化及中央–周边尺寸梯度。类器官不均一不仅造成形态差异，还诱导祖细胞与增殖标志物表达变化，最终导致实验变异。同时，FlatWell平台中气道上皮细胞常黏附于板面并以2D单层铺展，导致3D类器官与2D细胞共存，损害功能与分子检测等下游分析的准确性。此外，对验证气道类器官至关重要的IHC分析常因尺寸变异导致的回收效率降低，以及固定和后续处理过程中的类器官丢失与破碎而受影响。在4%多聚甲醛（PFA）固定过程中，尺寸异质性导致回收时大量类器官丢失，而3D类器官常与板面2D单层细胞共同黏附，进一步降低回收效率，致使IHC常显示破碎类器官或明显尺寸差异，难以可靠评估结构完整性与极性。为解决上述局限，研究人员开发了TransPillar培养平台以实现气道类器官的标准化形成。

**研究开展与结论**　TransPillar平台通过为加载气道上皮细胞–Matrigel混合物提供支柱引导表面，促进均一dome形成，降低对技术人员技能的依赖；一致的dome几何形状最小化高度和直径变化，改善dome间均一性，并稳定代谢活性，提高毒性检测和药物反应评价等高通量检测的准确性与可重复性。该平台中细胞–Matrigel混合物加载于支柱表面，结构随后倒置并固定于孔板；由于dome以倒置方向培养，类器官在重力影响下于支柱对侧生长，倒置几何形状亦最小化重力驱动的细胞与基质沉降，抑制中央–周边尺寸梯度并促进均一3D生长。因此类器官不黏附于支柱表面，较少以2D单层铺展，实现标准化3D类器官的专属形成。均一类器官形成亦有利于下游IHC分析，尺寸均一性使4% PFA固定后回收高效并最小化丢失；此外TransPillar培养的类器官在IHC过程中保持结构完整性和尺寸一致性，便于可靠评估顶端–基底极性和上皮细胞组成。综上，传统FlatWell培养存在dome形成、类器官尺寸和回收效率变异的缺陷，而TransPillar平台通过实现可重复dome形成、防止2D向外生长并促进结构完整类器官的高效回收，克服了这些挑战，为包括依赖可重复性的毒性和筛选应用在内的体外气道研究提供了有用平台。

**关键技术方法**　研究人员采用TransPillar平台（聚苯乙烯注塑成型，8支柱，支柱直径4 mm、高1 mm、表面曲率半径2.31），经70%乙醇清洗、紫外灭菌、等离子处理后以poly-L-lysine（PLL）包被增强黏附；以A549细胞及LV-eGFP-PKG-Puro转导的A549细胞作为替代模型，并以来源于肺癌手术切除正常气道组织的原代人气道上皮细胞构建人源气道类器官；通过Calcein-AM/Hoechst 33342荧光染色与共聚焦成像、H&E及IHC（P63、MUC4、MUC5AC、FOXJ1）染色、基于ATP的CellTiter-Glo 3D发光法回收率检测、基于GFP/Calcein-AM的荧光法固定后回收检测、流式细胞术及qRT-PCR进行评价；统计学采用双侧Welch非配对t检验、单因素方差分析及Tukey多重比较。

**研究结果**　2.1 通过TransPillar平台建立一致的A549球体培养：A549球体在两种平台培养6天，FlatWell平台dome基底部和外周的细胞常黏附板面并扩展为2D向外生长，而TransPillar平台类器官仅以3D构型生长、无2D向外生长；Hoechst 33342/Calcein-AM染色显示FlatWell平台dome内生长不均（中央小而稀疏、周边大而密集），TransPillar平台dome内生长均一；FlatWell平台周边球体直径40–140 μm、中央20–50 μm，TransPillar平台中央与周边尺寸分布相当；FlatWell平台A549球体log10转换平均面积为2.97，TransPillar平台显著增大至3.22，表明TransPillar促进更大球体形成并降低尺寸变异、改善dome内空间分布均一性。2.2 平台几何形状的结构与重力效应对3D球体尺寸分布的影响：在FlatWell平台，细胞和基质受重力驱动向板底沉降，细胞频繁穿透dome下部并以2D构型黏附板面，导致dome下部压缩及内部细胞密度异质性；中央球体较小（log转换平均直径1.61，变异系数7.58），周边较大（1.75，变异系数11.27），呈明显中央–周边尺寸梯度；Z轴分析显示中央区上部球体约29–39 μm、下部约51–53 μm，周边区上部约35–51 μm、下部约95–125 μm，表明该梯度并非源于培养基可及性或营养扩散差异，而是重力诱导的细胞与基质向下重新分布与平坦基底几何约束的共同结果。Bottom-side Pillar平台中支柱从板底伸出，dome形成于支柱表面并由支柱界面支撑，部分限制侧向铺展，但重力驱动沉降模式与FlatWell相似，仍观察到中央（1.61，变异系数7.18）与周边（1.77，变异系数8.52）的尺寸梯度，Z轴及周边分析同样显示下部球体更大。TransPillar平台中dome附着于上部支柱下方，形成倒置几何，重力驱动沉降不接触支柱表面，而是在基质内重新分布而非在刚性界面聚集；球体在整个培养过程中保持稳定3D结构，中央（1.89，变异系数6.84）与周边（1.85，变异系数8.26）尺寸分布相当，中央–周边尺寸梯度基本消失，上下部尺寸差异幅度明显小于其他平台，表明球体尺寸分布由重力方向性与平台几何的共同影响决定。2.3 TransPillar平台改善固定球体的回收效率：A549球体培养6天后以4% PFA固定，FlatWell平台板面可见残留Matrigel dome痕迹且部分球体仍附着，TransPillar平台表面无残留dome材料且无球体残留；H&E染色显示FlatWell平台球体数量较少且形态异质，TransPillar平台球体数量更多且形态更均一；基于发光的回收检测显示FlatWell组信号丢失35.2%、TransPillar组仅14.8%，基于荧光的检测显示FlatWell组丢失36.3%、TransPillar组15.7%，表明TransPillar平台回收效率显著更高，对使用有限临床样本的研究尤为重要。2.4 在人源气道类器官中验证TransPillar驱动的标准化：dome面积定量显示FlatWell平台dome间变异（CV=9.53%）大于TransPillar平台（CV=2.72%）；培养4周的长期培养中两平台类器官均持续生长，TransPillar平台在培养后期生长更佳且变异系数更低；Calcein-AM/Hoechst 33342染色显示FlatWell平台dome内生长异质（周边大而密集、中央小而稀疏），TransPillar平台整个dome生长均一；TransPillar平台相对荧光强度较FlatWell增加46.81%，变异系数（2.06%）明显低于FlatWell（17.18%）；TransPillar平台类器官平均面积（3.76 log[μm2]）高于FlatWell（2.58 log[μm2]），且在三个供体（AO_02、AO_03、AO_05）中一致观察到该趋势；FlatWell平台类器官常从dome下部脱落并黏附板面呈2D扩展，TransPillar平台类器官局限于3D dome结构内、无2D向外生长；回收后FlatWell平台残留类器官、丢失率14.2%，TransPillar平台仅0.6%；Calcein-AM荧光固定回收检测显示FlatWell组丢失48.8%、TransPillar组21.4%；H&E显示FlatWell来源类器官数量较少且尺寸异质，IHC证实P63、MUC4、MUC5AC、FOXJ1阳性细胞存在但大类器官常见折叠或撕裂伪影，而TransPillar来源类器官每张切片数量更多、圆形形态保持，IHC显示基底（P63+）、杯状（MUC4+和MUC5AC+）和纤毛（FOXJ1+）细胞群并清晰维持顶端–基底极性，IHC处理后仍保持完整形态；使用商品化气道类器官培养基的对比显示H&E、P63、MUC4、PAS和FOXJ1染色所示上皮形态与特征与实验室自制培养基相当。2.5 TransPillar诱导的结构均一性与上皮谱系组成的关系：对四个供体（AO_01–AO_04）来源气道上皮细胞在两平台培养后进行流式分析，与FlatWell相比，TransPillar培养的基底细胞比例降低（83.4% vs. 72.0%），杯状细胞（11.8% vs. 19.9%）和纤毛细胞（5.0% vs. 8.1%）比例升高，各供体内变化方向一致但幅度不同；象限图显示TransPillar平台Basal+Goblet?和Basal+Ciliated?群体较低，而Basal+Goblet+、Basal+Ciliated+、Basal?Goblet+和Basal?Ciliated+群体较高；以基底标志物KRT5归一化后，FlatWell培养中 club细胞标志物SCGB1A1、杯状细胞标志物MUC5AC和纤毛细胞标志物FOXJ1表达较低，TransPillar培养中较高（供体平均值分别为0.88、0.86、0.82 vs. 1.20、1.90、1.33），虽未达统计学显著性但趋势与细胞水平谱系变化一致；PM2.5暴露后，FlatWell平台dome内呈明显空间异质性（周边类器官较大、中央较小，中央区域尺寸减小更明显），TransPillar平台中央与周边区域类器官面积相当、反应更空间均一，且TransPillar平台dome间变异（CV=2.97%）明显低于FlatWell（CV=10.91%）；按直径分层（>150 μm、50–150 μm、<50 μm）的IHC分析显示FlatWell平台小类器官P63阳性基底细胞比例高，MUC5AC和FOXJ1阳性群体主要见于中等和大类器官，TransPillar平台罕见<50 μm类器官，同等尺寸类器官两平台谱系标志物表达差异不如整体谱系组成差异明显，支持类器官尺寸分布与上皮谱系组成之间的关联，提示FlatWell培养中较高的整体基底细胞比例至少部分反映异质类器官群体中存在小而富集基底细胞的结构，而TransPillar平台更均一的尺寸分布减少了此类小结构对整体上皮群体的贡献。综上，TransPillar平台的主要优势在于生成结构更均一的类器官群体而非直接改变上皮分化，通过减少小而富集基底细胞的类器官及dome内空间异质性，使上皮细胞群体呈现更一致的代表性，并在下游毒性检测中转化为更好的可重复性。

**讨论与结论**　讨论部分指出，TransPillar平台通过支柱引导设计实现一致直径Matrigel dome形成，物理约束促进均一球体生成，克服了FlatWell平台dome形态不一致与类器官生长异质的局限，而Matrigel dome不均一会导致类器官形态变异及祖细胞和增殖标志物表达差异，严重妨碍实验可重复性。该研究定量阐明了培养平台几何构型与重力影响如何决定3D球体的空间分布与尺寸形成：FlatWell和Bottom-side Pillar平台中dome直接接触水平基底，细胞与基质沿重力轴沉降，产生一致的上下及中央–周边尺寸梯度；TransPillar平台的倒置几何使球体不接触刚性基底，重力驱动沉降在基质内重新分布而非表面相关聚集，显著减小尺寸差异，表明基底支撑平台中重力依赖的生长偏倚被结构性地消除。高效回收气道类器官是IHC可靠验证的前提，FlatWell平台固定回收后常残留dome材料和黏附球体，对来源困难且量少的患者样本尤为关键，会减少可用于验证的类器官数量并导致评价偏倚；TransPillar平台的支柱引导设计支持一致dome形成并实现无残留的完全回收，且球体在石蜡包埋制备过程中保持形态，便于IHC可靠解读顶端–基底极性和上皮细胞组成。研究结论部分指出，TransPillar平台是克服传统FlatWell气道类器官培养局限的结构引导系统，通过促进一致的Matrigel dome形成，实现类器官均一空间分布与生长，确保培养可重复性；除结构优势外，TransPillar培养显示上皮谱系组成改变，表现为分化细胞群体相对富集，该转变可能并非源于分化的直接增强，而是结构均一性改善所致的组成偏倚减少——传统FlatWell培养中包括较小和分化较差结构在内的异质类器官群体可能使整体细胞组成偏向基底细胞主导状态，而TransPillar平台最小化该异质性，使分化上皮细胞类型呈现更一致的代表性；此外，TransPillar系统类器官回收显著更高效，最小化丢失并在组织学处理中保持形态，促进包括顶端–基底极性和上皮细胞类型分布评估在内的可靠IHC验证。综上，研究结果表明TransPillar平台为气道类器官培养和回收提供了标准化且可重复的方法，改善的结构均一性和回收效率可促进下游应用，尤其当患者来源材料有限且实验一致性重要时；因此TransPillar平台为未来需要可重复类器官形成、回收和下游分析的气道类器官研究提供了实用培养系统。