尼替西农老药新用联合索拉非尼经代谢应激驱动STING激活增敏微卫星稳定型结直肠癌免疫治疗

《Pharmacological Research》：Repurposing the orphan drug nitisinone synergizes with sorafenib to sensitize immunotherapy-refractory MSS-CRC via metabolic stress-driven STING activation

　　

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）的全球发病率和死亡率持续上升。尽管免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICI）已彻底改变了约15%错配修复缺陷（deficient mismatch repair, dMMR）和/或高微卫星不稳定性（microsatellite instability-high, MSI-H）CRC患者的治疗，但其余85%错配修复功能正常（proficient mismatch repair, pMMR）和微卫星稳定（microsatellite stability, MSS）的患者仍对ICI无应答。这种耐药性归因于低肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）、稀少的肿瘤抗原呈递，以及富集调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）的免疫抑制性微环境。当前将ICI与化疗或靶向治疗联合的策略收效有限，且受到脱靶毒性和短暂疗效的阻碍。新兴证据将代谢重编程指认为CRC细胞免疫逃逸的核心机制，其中CRC细胞线粒体和谷氨酰胺代谢的失调抑制了细胞毒性免疫浸润。尼替西农（nitisinone）是一种靶向4-羟苯丙酮酸双加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPD）的FDA批准孤儿药，通过调节线粒体谷氨酰胺代谢在肿瘤学中展现出临床前潜力。此外，环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子（cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes, cGAS-STING）轴作为细胞质DNA触发抗肿瘤免疫的核心介质，是连接代谢应激与免疫激活的可干预环节。新兴证据，特别是在肝癌、黑色素瘤和乳腺癌模型中，已确立空腹或空腹模拟饮食（fasting-mimicking diets, FMD）可增强索拉非尼（sorafenib）的抗肿瘤活性。然而，这一现象是否延伸至以代谢应激诱导细胞死亡抵抗著称的MSS-CRC，以及负责该效应的特定血清成分的身份，仍有待阐明。研究人员在本研究中验证了MSS-CRC中空腹-索拉非尼的协同效应，并鉴定出HPD是一个具有治疗可干预性的节点。通过尼替西农的老药新用，研究人员揭示了一条独特的机制轴：HPD抑制施加代谢陷阱，使MSS-CRC对索拉非尼诱导的不可逆线粒体灾难和后续cGAS-STING依赖性抗肿瘤免疫敏感化，从而将MSS-CRC转化为ICI应答性的“热”状态。研究人员的结果确立了一种安全性良好的三联方案（尼替西农+索拉非尼+抗PD-1），开创了孤儿药老药新用策略，以克服MSS-CRC中的ICI耐药性。

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球发病率和死亡率持续攀升的重大公共卫生挑战。尽管免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICI）在错配修复缺陷（deficient mismatch repair, dMMR）或高微卫星不稳定性（microsatellite instability-high, MSI-H）亚型中疗效确切，但占临床85%的微卫星稳定（microsatellite stability, MSS）患者表现为原发性耐药，其核心机制涉及低肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）、新抗原呈导匮乏，以及由调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）主导的免疫抑制性微环境。现有联合化疗或靶向治疗策略因脱靶毒性和短暂疗效而受限。近年来，代谢重编程被视为免疫逃逸的关键驱动因素，线粒体功能与谷氨酰胺代谢异常与免疫排斥密切相关。尼替西农（nitisinone）作为获批治疗遗传性酪氨酸血症I型的孤儿药，可通过调控线粒体谷氨酰胺代谢发挥抗肿瘤作用。环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子（cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes, cGAS-STING）通路是连接代谢应激与免疫激活的核心枢纽。发表于《Pharmacological Research》的这项研究，旨在系统探索尼替西农老药新用联合索拉非尼（sorafenib）及抗PD-1抗体克服MSS-CRC免疫治疗耐药的可行性。

为解析这一策略，研究人员首先建立药物筛选体系，在模拟空腹条件（1%胎牛血清联合低糖）下对MSS-CRC原代细胞进行高通量筛选，发现索拉非尼表现出最强的空腹依赖性细胞毒作用。随后利用50 kDa超滤膜分馏血清并进行无标记定量蛋白质组学分析，结合体外功能验证，鉴定出HPD为关键增敏节点。为阐明代谢交互机制，研究人员采用靶向代谢组学、U-13C₅-谷氨酰胺同位素示踪及Seahorse XF能量代谢分析，证实HPD抑制导致肿瘤细胞谷氨酰胺回补依赖；通过染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation-PCR, ChIP-PCR）验证cMYC（cellular myelocytomatosis oncogene）对谷氨酰胺酶1（glutaminase 1, GLS1）的转录调控，并借助蛋白质降解实验明确索拉非尼通过抑制cRaf（cellular rapidly accelerated fibrosarcoma）-MEK（mitogen-activated protein kinase kinase）-ERK（extracellular signal-regulated kinase）信号促进cMYC在Ser62位点的磷酸化失稳及蛋白酶体降解。研究还运用Airyscan超分辨率成像、透射电镜及ρ⁰（线粒体DNA缺失）细胞模型评估线粒体损伤与线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）释放，并建立患者来源类器官（patient-derived organoids）与自体外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）共培养体系、CT26同基因移植瘤及原位模型进行体内疗效验证，同时借助单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）解析肿瘤微环境重塑。

研究结果显示：在“药理学或饮食抑制酪氨酸分解代谢增强索拉非尼在MSS-CRC中的抗肿瘤效力”部分，尼替西农与索拉非尼在多种MSS-CRC模型中展现显著协同效应，酪氨酸/苯丙氨酸缺乏饮食或HPD沉默均可模拟此效应，且在SW480异种移植瘤中验证有效。在“酪氨酸与谷氨酰胺代谢的双向适应性交叉对话创造合成致死性代谢陷阱”部分，靶向代谢组学显示HPD阻断后谷氨酰胺回补增强，而GLS1抑制后酪氨酸分解代谢上调，证实双向代谢交叉对话；联合阻断形成不可逆代谢陷阱。在“索拉非尼破坏ERK介导的cMYC稳定化以抑制cMYC-GLS1轴”部分，RNA-seq揭示组合处理显著下调cMYC程序；ChIP-PCR证实cMYC直接结合GLS1启动子；索拉非尼抑制cRaf-MEK-ERK信号，促进cMYC蛋白酶体降解，从而抑制GLS1表达。在“尼替西农-索拉非尼诱导不可逆线粒体危机及多模态细胞死亡”部分，联合处理显著降低耗氧率（oxygen consumption rate, OCR），导致线粒体嵴结构紊乱、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, ΔΨ_m）崩溃、活性氧（reactive oxygen species, ROS）累积及线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）开放；ρ⁰细胞完全耐药证实线粒体依赖性。在“不可逆性线粒体损伤驱动mtDNA-cGAS-STING介导的先天免疫激活”部分，超分辨率成像显示mtDNA核小体与TOM20共定位丢失；联合处理激活STING-TANK-binding kinase 1（TBK1）磷酸化及I型干扰素表达；线粒体ROS清除剂Mito-TEMPO可部分延缓mtDNA释放，界定不可逆阈值。在“代谢-免疫共靶向克服MSS-CRC中的ICI耐药”部分，患者来源类器官中联合处理诱导凋亡，自体PBMC共培养证实免疫增强；CT26模型中三联方案实现最强肿瘤消退，多重免疫组化（multiplex immunohistochemistry, mIHC）显示多功能细胞毒性淋巴细胞浸润。在“线粒体损伤启动细胞死亡，而mtDNA-STING轴放大抗肿瘤免疫”部分，STING敲低不影响直接线粒体杀伤，但显著削弱三联疗效；scRNA-seq显示细胞毒性CD8⁺T细胞、自然杀伤（natural killer, NK）细胞及中性粒细胞扩增，T细胞受体（T cell receptor, TCR）信号程序富集；STING缺陷导致残余CD8⁺T细胞效应功能受损。在“三联方案在原位MSS-CRC中诱发显著肿瘤消退且安全性良好”部分，第15天时75%动物接近完全肿瘤消退，主要器官无组织学异常。在“双低谷氨酰胺/酪氨酸代谢状态鉴定MSS-CRC中STING驱动的免疫激活及免疫热表型”部分，癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和基因表达综合（Gene Expression Omnibus, GEO）队列分析显示，谷氨酰胺/酪氨酸代谢双低（Double_Low）肿瘤患者生存更优，呈现cGAS-STING信号富集、I型干扰素应答增强及免疫细胞浸润增加。

在讨论部分，研究人员指出，双代谢靶向创造了合成致死窗口。与恢复氧化还原的干预不同，尼替西农通过HPD抑制放大索拉非尼诱导的线粒体功能障碍。HPD缺失触发代偿性谷氨酰胺回补，而索拉非尼通过抑制cRaf-MEK-ERK-cMYC轴下调GLS1，二者共同将适应性代谢交叉对话转化为不可逆致死性。线粒体损伤作为“触发子”启动肿瘤细胞死亡，而mtDNA-STING信号作为“放大器”动员抗肿瘤免疫。TCGA和单细胞数据分析进一步支持谷氨酰胺/酪氨酸代谢状态与免疫热表型及预后的关联，提示连续代谢评分可作为免疫治疗反应的预测性生物标志物。三联方案具有安全性良好、可快速老药新用、同时激活肿瘤固有免疫原性和系统抗肿瘤免疫的优势。研究局限性指出，MSS-CRC免疫治疗反应还受癌基因与基因组背景、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相关可塑性、单细胞瘤内异质性及微生物群衍生代谢产物的影响。尽管体外尼替西农浓度（150–300 μM）高于遗传性酪氨酸血症患者报告的血浆峰值浓度（约120 μM），但10 mg/kg剂量在动物模型中显示疗效，提示需进一步开展专门药代动力学研究以明确CRC中的有效肿瘤浓度。总体而言，酪氨酸-谷氨酰胺互惠交叉对话揭示了MSS-CRC中可干预的脆弱性，支持将相互连接的氨基酸网络共靶向作为克服免疫治疗耐药的通用策略。研究结论强调，该工作将免疫治疗框架超越基因组不稳定性，确立线粒体代谢应激作为STING依赖性免疫识别的驱动力，通过将“冷”MSS-CRC转化为免疫原性热点，为ICI难治性MSS-CRC的个性化治疗提供了蓝图。