《Regional Studies in Marine Science》：Metabarcoding of Mediterranean monk seal (
Monachus monachus) scats from the isolated population of Madeira reveals a diverse piscivorous diet
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地中海僧海豹（*Monachus monachus*）是全球最受威胁的鳍足类动物，曾因人类迫害、栖息地丧失、干扰及渔业相互作用而经历严重的历史性衰退。目前，其繁殖仅限于东地中海和中—东大西洋少量地理隔离的亚种群。马德拉种群表现出极低的遗传多样性，所有采样个体共
地中海僧海豹（*Monachus monachus*）是全球最受威胁的鳍足类动物，曾因人类迫害、栖息地丧失、干扰及渔业相互作用而经历严重的历史性衰退。目前，其繁殖仅限于东地中海和中—东大西洋少量地理隔离的亚种群。马德拉种群表现出极低的遗传多样性，所有采样个体共享完全相同的线粒体基因组，核遗传多样性也极低（He ≈ 0.04），表明该种群经历了严重的遗传瓶颈。了解该物种的食性对其保护至关重要，但传统基于胃含物分析的方法存在机会性采样、 prey 鉴定偏差及时空分辨率有限等缺陷。本研究对2014年12月至2021年7月间在马德拉岛和德塞塔斯群岛采集的16份地中海僧海豹粪便样本（其中14份用于遗传分析）进行了DNA宏条形码分析，利用MiFish引物对（MiFish-U和MiFish-E）扩增线粒体12S rRNA基因片段，结合Illumina NovaSeq 6000高通量测序，并通过BLAST比对NCBI核苷酸数据库进行物种注释。研究共获得8,468,273条原始读序，聚类为7,628个操作分类单元（OTU），其中193个OTU以≥98%的相似性成功注释到鱼类，最终鉴定出51个鱼类分类单元，包括38个在马德拉群岛有记录的种类和13个无本地记录的类群。频率出现度（FO）分析显示，欧洲康吉鳗（*Conger conger*）和糙尾魟（*Bathytoshia centroura*）为最常检测到的猎物（FO = 92.9%），其次为地中海海鳝（*Muraena helena*，85.7%）、腋斑鲷（*Pagellus acarne*，78.6%）和赤鲷（*Pagrus pagrus*，78.6%）。食性以底栖和岩礁关联鱼类为主，其中鲷科（Sparidae）种类最丰富。软骨鱼类（如鳐类）在多个样本中反复检出，表明其在可检测猎物谱系中占据稳定地位。此外，研究还检出了非猎物DNA，如马德拉壁蜥（*Teira dugesii*），可能为环境痕迹。研究还发现，多种猎物与当地商业和休闲渔业重叠，包括欧洲沙丁鱼（*Sardina pilchardus*）、竹荚鱼（*Scomber colias*）、赤鲷（*Pagrus pagrus*）等，暗示僧海豹与渔业之间存在潜在竞争。金头鲷（*Sparus aurata*）的检出可能指示其与当地水产养殖存在一定相互作用，但野生猎物占主导表明养殖并非主要食物来源。本研究首次利用DNA宏条形码对马德拉孤立种群进行食性分析，实现了高分辨率的物种鉴定，克服了传统形态学方法的消化偏差和鉴定局限，为小型、易受干扰的鳍足类种群的营养生态监测提供了可扩展的非侵入性工具，并为制定针对性保护策略奠定了数据基础。
**论文解读：基于粪便DNA宏条形码的马德拉地中海僧海豹食性研究**
**1. 研究背景与科学问题**
地中海僧海豹（*Monachus monachus*）是全球最濒危的鳍足类动物，历史上曾广泛分布于地中海、马尔马拉海、黑海以及非洲大西洋沿岸和馬卡罗尼西亞群岛。由于人类迫害、栖息地破坏、干扰和渔业误捕，其分布范围急剧收缩，现仅存于东地中海和中—东大西洋的少数地理隔离亚种群。马德拉种群是四个遗传分化种群之一，表现出极低的遗传多样性：所有个体共享相同的线粒体基因组，核杂合度仅约0.04（H
e），为鳍足类中最低水平之一。这种遗传瓶颈源于长期隔离、小种群规模和近交，增加了灭绝风险。尽管近年种群数量略有回升，但保护需求依然迫切。
了解僧海豹的食性对于制定有效保护措施至关重要，因为它能揭示栖息地利用、猎物偏好、生态角色以及人与海豹的潜在冲突。然而，传统食性研究方法存在明显局限：胃含物分析依赖搁浅个体的机会性采样，只能反映最近摄入且常被部分消化的猎物，导致物种鉴定偏差；稳定同位素分析虽能提供长期营养生态位信息，但缺乏物种级分类分辨率。因此，需要一种高分辨率且非侵入性的方法来实现精确的食性 profiling。DNA宏条形码技术通过扩增降解DNA中的短遗传标记并比对参考数据库，已在其他鳍足类中成功应用，但在马德拉僧海豹中尚属空白。本研究旨在利用粪便DNA宏条形码表征马德拉孤立亚种群的鱼类食性，建立高分辨率基线数据，并评估该方法在濒危小型种群监测中的应用价值。
**2. 研究设计与关键技术方法**
研究人员于2014年12月至2021年7月在马德拉岛和德塞塔斯群岛的沿海洞穴和上岸沙滩采集了16份地中海僧海豹粪便样本，其中14份通过质量控制用于后续分析。样本采集由IFCN-IP（马德拉森林与自然保护研究所）工作人员完成，仅在僧海豹不在场时收集以避免干扰。DNA提取使用QIAamp Fast DNA stool kit，并针对粪便样本优化了匀浆和洗脱步骤。PCR扩增采用MiFish引物对（MiFish-U和MiFish-E），分别靶向硬骨鱼和软骨鱼线粒体12S rRNA基因的短片段（约170 bp和180 bp）。每个样本进行四次PCR重复以降低随机扩增偏差，产物纯化后等摩尔混合，在Illumina NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序。生物信息学流程包括：使用Cutadapt去除标签和引物序列，VSEARCH进行双端合并（最小重叠10 bp，允许5个错配），严格过滤（长度≥150 bp，期望错误≤2.0），去冗余后用UCHIME de novo去除嵌合体，按97%相似度聚类为OTU。物种注释通过BLAST比对NCBI核苷酸数据库，保留序列一致度≥98%、e值≤1e-5且查询覆盖率100%的匹配，并依据马德拉群岛海洋生物多样性数据库和FishBase等资料将注释物种分为“本地有记录”和“本地无记录”两类。饮食指标采用频率出现度（FO），即某猎物在14个样本中出现的比例。
**3. 主要研究结果**
* **测序与OTU概况**：14个样本共获得8,468,273条原始读序，经聚类产生7,628个OTU，每个样本的OTU丰富度介于179至960之间，其中DES_07最高，DES_02最低。经高质量过滤后，193个OTU以≥98%的序列相似性成功注释到鱼类，归属于51个鱼类分类单元，其中38个为马德拉群岛已有记录的种类。
* **核心猎物组成**：根据FO分析，最常检出的本地记录猎物为欧洲康吉鳗（*Conger conger*）和糙尾魟（*Bathytoshia centroura*），两者FO均为92.9%（13/14样本）；其次为地中海海鳝（*Muraena helena*，85.7%）、腋斑鲷（*Pagellus acarne*）和赤鲷（*Pagrus pagrus*），FO均为78.6%。中频猎物（FO 35%–65%）包括灰鳞鲀（*Balistes capriscus*）、欧洲无须鳕（*Merluccius merluccius*）、欧洲海鲈（*Dicentrarchus labrax*）、白鲷（*Diplodus sargus*）、欧洲沙丁鱼（*Sardina pilchardus*）和金头鲷（*Sparus aurata*）。低频猎物（FO 7.1%–28.6%）包括蓝竹荚鱼（*Trachurus picturatus*）、鲐鱼（*Scomber colias*）等。这些猎物隶属24个科，其中鲷科（Sparidae）物种最丰富（7种），其次为隆头鱼科、康吉鳗科和海鳝科。
* **软骨鱼类检测**：通过MiFish-E引物，研究人员在多个样本中检测到软骨鱼类DNA，包括糙尾魟（*Bathytoshia centroura*，13/14）、龟魟（*Dasyatis tortonesei*，6/14）、大理石电鳐（*Torpedo marmorata*，6/14）和普通魟（*Dasyatis pastinaca*，2/14）。这些物种在以往基于形态学的研究中常因软骨易被胃酸降解而难以检出。
* **非本地记录类群及污染控制**：另检出13个马德拉群岛无正式记录的种类，如黄尾鰤（*Seriola lalandi*，FO=78.6%）。研究人员认为这些结果很可能源于本地参考数据库不完整导致的生物信息学误分配——例如，太平洋物种*Pontinus macrocephalus*和*Helicolenus avius*的检出，可能是因其12S rRNA序列与当地原生物种*Pontinus kuhlii*和*Helicolenus dactylopterus*高度相似。此外，样本中检测到非猎物DNA，包括僧海豹自身DNA（全部样本）和马德拉壁蜥（*Teira dugesii*，3/14），后者可能作为环境痕迹被动摄入，已从食性分析中排除。
* **与渔业和水产养殖的重叠**：多种检出猎物是马德拉群岛商业和休闲渔业的重要目标，如竹荚鱼、欧洲沙丁鱼、赤鲷、黑斑鲷（*Pagellus bogaraveo*）、粉红牙鲷（*Dentex gibbosus*）等。金头鲷（*Sparus aurata*）在5个样本中出现（FO=35.7%），而该物种是当地水产养殖的主要养殖种，且已有逃逸个体在野外建立种群。但研究人员指出，所有检出金头鲷的样本同时包含多种其他猎物，表明僧海豹主要捕食野生个体，而非专门依赖养殖设施。
**4. 讨论与结论**
本研究首次通过粪便DNA宏条形码揭示了马德拉孤立种群地中海僧海豹的鱼类食性，实现了物种水平的高分辨率鉴定。与传统胃含物分析相比，该方法克服了消化偏倚和形态鉴定困难，尤其提高了对软骨鱼类等易降解猎物的检出能力。食性组成以底栖和岩礁关联鱼类为主，反映了僧海豹主要利用近岸和大陆架生境，同时也能捕食中上层群游鱼类，体现了其作为泛化捕食者的生态灵活性。多个猎物物种与先前在东地中海种群中报道的猎物重叠，表明该物种存在跨区域的共享食性成分，而差异部分则可能反映区域猎物可获得性的不同。
研究检出的非本地记录类群凸显了参考数据库不完整对宏条形码分析的制约，提示未来需加强本地物种DNA条形码参考库建设。此外，猎物与渔业目标的高度重叠暗示僧海豹与当地渔业之间存在潜在竞争关系，但由于本研究仅基于频率出现度，无法量化竞争的强度，需谨慎解读。金头鲷的检出提示与水产养殖可能存在一定相互作用，但证据尚不充分。
总之，DNA宏条形码作为一种非侵入性工具，可为小型、易受干扰的濒危种群提供可扩展的营养监测手段。本研究建立的食性基线为马德拉僧海豹的保护管理提供了科学依据，有助于识别关键栖息地和猎物资源，从而制定更具针对性的保护措施，促进该物种在环境变化和人类压力下的长期恢复。
