空间转录组学揭示非小细胞肺癌免疫排斥相关的肿瘤内在与基质程序

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Spatial transcriptomics identifies tumor-intrinsic and stromal programs associated with immune exclusion in NSCLC

　　

免疫检查点阻断（ICB）重塑了晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗格局，然而持久获益仍仅限于一部分患者。一种主要的耐药模式是免疫排斥，即CD8+ T细胞积聚在基质区域但未能浸润肿瘤巢。在本研究中，利用接受ICB治疗的NSCLC患者的发现队列和非重叠内部验证队列，研究人员表明空间CD8+ T细胞排斥与较低的客观缓解率和较短的无进展生存期相关。为了刻画与该表型相关的分子程序，研究人员整合了GeoMx空间转录组学、批量转录组学分析、TCR探针表达分析、多重免疫组织荧光以及单细胞空间邻域分析。与浸润性肿瘤相比，免疫排斥性肿瘤在肿瘤区室中表现出编码抗原呈递机制的基因表达降低，包括HLA I类基因和TAP1，并且IFN-γ相关转录信号与抗原呈递机制表达之间的关系发生改变。在基质水平上，排斥性肿瘤富含肌成纤维细胞样癌症相关成纤维细胞程序和上皮周围胶原丰富结构，而浸润性肿瘤则呈现免疫支持性基质特征。来自排斥性肿瘤的CD8富集区域显示出代谢激活减弱和TCR探针表达多样性降低，而没有典型的耗竭标志物显著增加。这些发现提供了对NSCLC中与免疫排斥相关的肿瘤内在和基质特征的整合性、区室解析描述，并支持将空间免疫环境作为ICB治疗患者中补充生物标志物的进一步评估。

研究背景与科学问题

非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管免疫检查点阻断（ICB）疗法改善了部分晚期患者的预后，但多数患者仍因原发性或获得性耐药而无法获益。现有临床生物标志物如PD-L1表达和肿瘤突变负荷，无法充分解释免疫治疗反应的异质性，尤其缺乏关于免疫细胞相对于肿瘤上皮的空间组织信息。CD8⁺ T细胞的空间定位——即它们是位于肿瘤巢内、滞留于基质界面还是完全缺失——决定了其生物学意义和临床影响。免疫排斥表型指CD8⁺ T细胞存在于组织中但被限制在基质区域而未能浸润肿瘤巢，这一表型与ICB耐药密切相关，但其维持空间分离的机制尚不完全清楚。为此，研究人员开展了一项整合空间转录组学、批量转录组学、多重成像和单细胞空间分析的转化研究，旨在从肿瘤内在、基质和免疫三个维度系统刻画免疫排斥的分子特征。

研究方法与技术路线

本研究纳入来自前瞻性BIP精准医学研究（NCT02534649）的261例晚期NSCLC患者，分为发现队列（144例）和内部验证队列（117例）。核心技术方法包括：基于CD8和泛角蛋白免疫组化结合病理医师评估与数字图像分析的免疫表型分类；GeoMx数字空间剖绘仪全转录组图谱进行肿瘤、基质和CD8富集区域的区室化空间转录组学分析；HTG EdgeSeq全转录组检测进行批量转录组学验证；多重免疫组织荧光（mIHF）在蛋白质水平验证细胞亚群和空间分布；以及单细胞空间邻域分析和TCR探针表达多样性评估。

研究结果

免疫表型分类与临床结局关联：基于CD8⁺ T细胞空间分布将肿瘤分为浸润型、排斥型和荒漠型。在发现队列中，浸润型占21.5%，排斥型占43.8%，荒漠型占34.7%。浸润型肿瘤中位无进展生存期（PFS）为12.8个月，显著优于排斥型的4.1个月和荒漠型的2.8个月。客观缓解率在浸润型为58%，排斥型为38%，荒漠型仅为20%。内部验证队列一致证实了这一模式。多变量分析显示，免疫表型与预后的关联独立于ECOG体能状态、PD-L1表达和三级淋巴结构存在等协变量。

空间转录组学揭示肿瘤细胞免疫原性降低：通过GeoMx空间转录组学比较免疫排斥性与浸润性肿瘤的肿瘤区室，发现排斥性肿瘤中抗原加工和呈递相关基因（包括HLA-A、HLA-B、HLA-F和TAP1）表达显著下调。IFN-γ信号与抗原呈递机制之间的正相关性在浸润性肿瘤中存在（HLA：r=0.49；TAP1：r=0.59），而在排斥性肿瘤中消失。残差分析显示排斥性肿瘤的HLA表达比基于IFN-γ信号预测值低21.8%，提示存在额外的肿瘤内在调控机制。HLA等位基因分型表明下调主要涉及广义转录抑制。批量转录组学和多重免疫组织荧光验证了上述发现，并显示浸润性肿瘤中HLA-ABC⁺肿瘤细胞比例更高。单细胞空间邻域分析表明，HLA-ABC⁺肿瘤细胞周围CD8⁺ T细胞和M1样巨噬细胞的密度更高，这种差异在免疫排斥性肿瘤中更为显著。

基质区室中肌成纤维细胞样CAFs富集：空间转录组学分析基质区室发现，排斥性肿瘤基质呈现基质重塑和免疫调节特征，而浸润性肿瘤基质则富集免疫支持性细胞类型。多重免疫组织荧光分析揭示了成纤维细胞亚群的定性差异：排斥性肿瘤富含肌成纤维细胞样癌症相关成纤维细胞（myCAFs，定义为COL1A1⁺/αSMA⁺/TGF-β⁺/CD74^-），而浸润性肿瘤则以炎症性CAFs（iCAFs，COL1A1⁺/αSMA^-/CD74^-/IL-6⁺）为主。空间邻近分析显示，myCAFs在排斥性肿瘤中更靠近肿瘤上皮细胞，且myCAFs靠近肿瘤细胞与CD8⁺ T细胞远离肿瘤细胞相关，后者与较短的PFS相关。

CD8富集区域的T细胞状态与TCR多样性：空间转录组学比较CD8富集区域发现，浸润性肿瘤中的CD8⁺ T细胞富集翻译活性和氧化磷酸化相关转录本，提示更高的活化和分化状态。排斥性肿瘤中CD8⁺ T细胞则上调PTK6和UNC5A等基因。TCR探针表达分析显示，排斥性肿瘤的Shannon熵更低而Gini系数更高，提示TCR探针表达多样性降低。值得注意的是，经典免疫检查点分子（PDCD1、HAVCR2、LAG3、TIGIT）的表达在两个表型间无显著差异，多重免疫组织荧光也未发现表型耗竭CD8⁺ T细胞频率的差异，提示排斥性肿瘤中的T细胞功能障碍并非由经典耗竭驱动，而更可能与代谢和空间限制导致的活化失败有关。

讨论与结论

本研究在大型临床注释NSCLC队列中整合验证了免疫排斥表型与ICB不良预后的关联，并通过多变量建模确认其独立性。研究发现免疫排斥性NSCLC呈现协调性的双重程序：肿瘤内在的抗原呈递机制下调（HLA I类和TAP1表达降低，且与IFN-γ信号的关联异常）和基质区室的myCAFs富集及其近上皮定位形成物理屏障。CD8⁺ T细胞虽存在于基质但处于功能静息状态，表现为代谢活性降低、TCR多样性受限，而非典型耗竭。这些发现将既往独立描述的抗原呈递缺陷、基质重塑和T细胞功能障碍整合于区室解析的空间框架内，并直接关联至临床结局。研究提示靶向基质重塑通路（如TGF-β信号）或恢复肿瘤抗原呈递能力的联合策略可能是克服免疫排斥的潜在方向，但需功能性验证。总体而言，该研究支持将空间免疫环境作为ICB治疗患者的补充生物标志物，并为未来功能研究和转化应用提供了结构化基础。