《Scientia Horticulturae》：Effects of DNA methyltransferase inhibitor on fruit quality revealed by integrated DNA methylome analysis in
Ziziphus jujuba cv. Dongzao
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5-氮杂胞苷（5-Azacytidine，5-azaC）处理加速了冬枣（Ziziphus jujuba cv. Dongzao）的着色并改善了其果实品质。50 μmol·L?1处理产生了最佳的综合品质响应：糖分、维生素C（Vitamin
5-氮杂胞苷（5-Azacytidine，5-azaC）处理加速了冬枣（Ziziphus jujuba cv. Dongzao）的着色并改善了其果实品质。50 μmol·L?1处理产生了最佳的综合品质响应：糖分、维生素C（Vitamin C）和可溶性固形物（soluble solids）含量升高，而果实酸度下降。全基因组甲基化分析揭示了序列背景特异（context-specific）的表观遗传偏移（epigenetic shifts）。与甲基化相关的基因富集于果实成熟（ripening）、氧化还原（redox）及品质形成相关通路。
研究背景
DNA甲基化（DNA methylation）是由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）催化、将甲基基团添加至胞嘧啶第五位碳上的表观遗传修饰，不改变DNA碱基序列但可调控染色质状态、转座子活性与转录。与动物不同，植物DNA甲基化具有CG、CHG、CHH三种序列背景（H代表A、T或C），参与果实成熟等生长发育过程。5-氮杂胞苷（5-Azacytidine，5-azaC）作为DNA甲基化抑制剂可诱导植物基因组脱甲基化，但其在果实品质调控中的作用尚缺乏系统研究。全基因组亚硫酸氢盐测序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）可在单碱基分辨率下鉴定全基因组甲基化位点。枣（Ziziphus jujuba）是我国重要果树，冬枣（Ziziphus jujuba cv. Dongzao）为优良鲜食品种，解析其品质形成的表观遗传机制具有重要意义。
研究内容与主要结论
研究人员以8年生冬枣树为试材，设置0、50、100、150 μmol·L
?1四个5-azaC浓度处理，分别于处理后5天和10天取样，测定果实外观、色泽、风味营养、质构及抗氧化生理指标，并对50 μmol·L
?1处理开展WGBS分析。结果表明，50 μmol·L
?1处理综合效果最佳：促进果实提前着色，提高单果重、糖、维生素C和可溶性固形物含量，降低酸含量，改善质构，同时提高POD、SOD、CAT活性并控制MDA积累；5-azaC处理降低冬枣全基因组DNA甲基化水平，差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMRs）相关基因主要富集于果实成熟、氧化还原及品质形成相关通路。该研究为理解DNA甲基化与冬枣果实品质形成的关联提供了初步表观遗传证据，并评估了5-azaC在果实品质调控中的应用潜力。
关键技术方法
样本为8年生冬枣果实，设0、50、100、150 μmol·L
?1四个5-azaC处理，每处理3个生物学重复。关键技术方法包括：（1）果实品质测定——单果重用电子天平，果形指数按纵径/横径计算，HP-200色差仪测定L*、a*、b*、h°色泽参数，WYT-A手持折射仪测可溶性固形物，NaOH滴定测总酸，蒽酮比色法测总糖，2,6-二氯酚靛酚（2,6-dichlorophenolindophenol，DCPIP）滴定测维生素C，TMS-PRO质构仪测定硬度、破裂力、弹性、内聚性、粘附性、胶黏性和咀嚼性；（2）抗氧化生理指标测定——过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）用Solarbio试剂盒微板法；（3）WGBS分析——重亚硫酸盐转化、Illumina PE150测序、Bismark比对、DSS鉴定DMR、10 kb滑窗计算甲基化水平（ML），GOseq与KOBAS 3.0分别开展GO与KEGG通路富集分析。
3.1 5-azaC处理起始着色期的果实色泽变化
50、100、150 μmol·L
?1处理均促进冬枣果实由白熟期向半红期过渡时提前着色，其中50 μmol·L
?1效果最显著，表明适宜浓度5-azaC可通过调控果实发育相关生理进程加速着色。
3.2 5-azaC处理对果实发育与生理的影响
外观上，50 μmol·L
?1处理在最后一次施用10天后单果重最高（22.83 g），纵、横径最大，果形指数变化较小。色泽上，该处理L*值最低（41.34）、a*值最高（4.83）、b*值（28.42）与h°值（89.59）最低，褪绿转红效果最佳。风味与营养上，该处理维生素C（358.23 mg·(100 g)
?1）、可溶性固形物（20.95%）和总糖（17.22%）均为最高，总酸（0.43%）最低，糖酸比（40.40）与可溶性固形物/酸比（49.13）最高；100和150 μmol·L
?1处理效果较弱，部分指标低于对照。质地上，该处理硬度（7.70 N）、破裂力（5.79 N）、粘附性（0.18 mJ）、咀嚼性（2.36 mJ）及弹性（1.40 mm）均最低，内聚性略降，表明该处理可降低果实硬度与脆度、改善口感与加工适宜性。
3.3 5-azaC处理后冬枣果实的全基因组亚硫酸氢盐测序分析
9个文库测序质量高（Q30均值94.83%，重亚硫酸盐转化率99.514%–99.622%），生物学重复间甲基化水平相关系数均大于0.99。CK1、CK10、T10三组CG、CHG、CHH甲基化水平均表现为CG最高（T10为36.72%）>CHG（24.39%）>CHH（6.40%）；处理组全基因组mC百分比（10.59%）低于水对照（10.67%），CG、CHG、CHH背景均呈降低趋势，CHH背景甲基化C位点占比最高（超过55.7%），且启动子、外显子、内含子及CGI区域甲基化水平在三种背景下均低于对照。CK10与T10间共鉴定出2437个基因组DMR和2577个启动子DMR，其中超甲基化DMR 11720个、低甲基化DMR 5636个，CG、CHG、CHH背景下均存在大量低甲基化DMR，支持5-azaC的脱甲基作用；DMR长度呈右偏分布，主要集中于约100 bp短片段。DMR相关基因GO富集于基础代谢、物质运输、氧化还原调节及细胞组分维持；KEGG富集于淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷和黄酮类生物合成、植物激素信号转导、MAPK信号、抗坏血酸和醛酸代谢及氧化磷酸化等通路，提示甲基化变化与糖酸代谢、色泽形成、果实软化及抗氧化防御相关。
讨论
作者强调，本研究未开展基因表达分析（未进行RNA-seq）及代谢流直接测定，GO与KEGG富集结果仅提示DMR相关基因潜在功能关联，不能证明相应基因表达或代谢物丰度的直接变化；DMR相关基因不应被解读为差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。因此，DNA甲基化与维生素C、糖、可溶性固形物及有机酸积累的关系应视为潜在间接关联而非直接因果效应，未来需结合RNA-seq、代谢组学及候选基因表达验证阐明5-azaC影响果实品质的分子机制。
结论
本研究表明，不同浓度5-azaC处理可影响冬枣果实着色、品质形成与抗氧化生理状态，50 μmol·L
?1处理综合效果最佳：促进果实提前着色，增加单果重、糖含量、可溶性固形物及维生素C含量，降低酸含量，改善质构，提高POD、SOD、CAT活性并维持氧化还原平衡；而150 μmol·L
?1处理使MDA积累升高，过高浓度可能加剧膜脂过氧化损伤。WGBS分析表明，5-azaC降低了冬枣全基因组DNA甲基化水平并影响CG、CHG、CHH三种序列背景的甲基化状态；差异甲基化基因主要富集于代谢过程、氧化还原过程、淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导以及苯丙烷和黄酮类生物合成等通路，提示5-azaC诱导的DNA甲基化变化与糖酸代谢、色泽形成、细胞壁代谢、抗氧化防御及果实成熟等过程存在潜在关联。在本研究条件下，50 μmol·L
?1为最佳处理浓度。
