UV-B光受体PavUVR8通过直接激活PavMYB75L启动子介导甜樱桃果实花青素生物合成

《Scientia Horticulturae》：UV-B photoreceptor PavUVR8 mediates anthocyanin biosynthesis by directly activating PavMYB75L expression in sweet cherry fruits

　　

• 在强光条件下，PavUVR8存在于细胞核（nucleus）和细胞质（cytoplasm）中。
• 沉默PavUVR8抑制甜樱桃（Prunus avium L.）果实中的花青素（anthocyanin）生物合成。
• 在甜樱桃果实愈伤组织（calli）中过表达（overexpression，OE）PavUVR8可促进花青素生物合成。
• PavUVR8直接结合PavMYB75L、PavDFR和PavANS的启动子（promoter）区域以激活转录。

果实色泽是影响甜樱桃（Prunus avium L.）商业价值的重要性状，直接反映果实成熟度和风味特征。甜樱桃果实的色泽外观主要源于花青素（anthocyanin）的积累。根据色泽差异，甜樱桃可分为红色品种和黄色品种：纯红色和紫黑色品种属于红色类型，而黄红色（blush，红晕）和纯黄品种属于黄色类型。前期研究表明，PavMYB10.1/PacMYBA是决定甜樱桃果皮着色的关键基因，其不表达导致果皮呈黄色，高表达则导致果皮呈红色。近期研究发现，PavMYB75-like（PavMYB75L）编码一个调控黄红色甜樱桃果实色泽的调节因子，该基因在纯黄色甜樱桃果实中不表达。R2R3-MYB转录因子（transcription factor，TF）是多种植物花青素生物合成的核心调控因子，它与碱性螺旋-环-螺旋（basic helix–loop–helix，bHLH）转录因子及WD重复蛋白（WD repeat protein）形成MBW复合体，直接诱导花青素生物合成途径晚期基因（DFR、ANS和UFGT）以及花青素转运基因GST的表达，从而促进花青素合成。

尽管遗传因素决定花青素类型和合成时间模式，环境因素如光照强度也显著影响花青素合成速率和积累量。光照暴露与多种植物果实中的花青素积累密切相关，尤其是蓝光和紫外辐射（ultraviolet，UV）。在植物中，抗紫外辐射位点8（UV RESISTANCE LOCUS 8，UVR8）是感知UV-B辐射的光受体，被认为是帮助植物抵御UV辐射潜在有害效应的“分子防晒霜”，通过激活保护机制发挥作用。大量研究表明，UVR8信号通路调控多种UV-B响应过程，包括下胚轴伸长、侧根发育、向光性、开花时间、光形态建成及生物和非生物胁迫响应，同时影响花青素合成以增强UV耐受性。然而，尽管UVR8作为光受体的功能已被详细表征，其在园艺作物中调控类黄酮次生代谢物（如花青素生物合成）的功能和相关分子机制仍相对未知。

在本研究中，研究人员以黄红色甜樱桃品种“明珠”（Mingzhu）为研究对象，聚焦UV辐射增加花青素积累的分子机制，对PavUVR8进行了功能鉴定。研究通过病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）和过表达（overexpression，OE）甜樱桃果实愈伤组织遗传分析，证实PavUVR8促进花青素积累。进一步利用酵母单杂交（yeast one-hybrid，Y1H）、染色质免疫共沉淀结合定量PCR（chromatin immunoprecipitation followed by quantitative PCR，ChIP-qPCR）以及双荧光素酶报告系统（dual-luciferase reporter assay），证明PavUVR8可直接结合花青素积累相关基因（PavMYB75L、PavDFR和PavANS）的启动子区域以增加转录。这些发现阐明了PavUVR8对花青素生物合成的调控效应，为理解黄红色甜樱桃果实中UV辐射诱导花青素积累的机制提供了新见解。

研究人员综合运用了多种关键技术手段开展本研究。在基因功能验证方面，采用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）介导的病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，在甜樱桃果实中瞬时沉默PavUVR8；同时利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术，将35S::PavUVR8过表达载体导入由“雷尼尔”（Rainer）黄红色甜樱桃果实诱导的愈伤组织中，获得稳定遗传的转基因材料。在分子机制解析方面，运用酵母单杂交（Y1H）实验体外验证PavUVR8与靶基因启动子的结合能力；通过染色质免疫共沉淀结合定量PCR（ChIP-qPCR）技术，在PavUVR8-GFP过表达愈伤组织中验证其在体内对含有G-box结合位点（CACGTC/AACGTC）的启动子片段的直接结合；采用双荧光素酶报告系统（dual-LUC），在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中检测PavUVR8对PavMYB75L、PavDFR和PavANS启动子的转录激活作用。研究样本主要来源于中国农业科学院郑州果树研究所国家果树种质郑州桧纺桧资源圃种植的“明珠”甜樱桃果实，以及“雷尼尔”黄红色甜樱桃果实诱导的愈伤组织。

果实着色相关PavUVR8表达模式及编码蛋白的亚细胞定位。研究人员通过qRT-PCR分析了PavUVR8在黄红色甜樱桃果实七个发育阶段（幼绿、大绿、开始褪绿、黄白、开始着色、完全着色、橙红）黑暗和光照条件下的表达模式。结果显示，PavUVR8表达在黄白色阶段后显著升高，表明其可能参与调控果实着色；黑暗条件下，PavUVR8在整个果实发育和成熟过程中维持低水平表达。亚细胞定位分析表明，在光照条件下，PavUVR8-GFP融合蛋白在本氏烟草叶片表皮细胞的细胞核和细胞质中均有分布；而在黑暗条件下，该融合蛋白仅分布于细胞质中。

基于VIGS的PavUVR8沉默抑制甜樱桃果实花青素生物合成。研究人员利用TRV介导的VIGS技术沉默黄红色甜樱桃果实中的PavUVR8。接种后10天，沉默果实中PavUVR8转录水平显著低于对照；接种后21天，对照果实呈红色，而PavUVR8沉默果实呈黄红色。与对照相比，沉默果实在花青素含量上显著降低。此外，PavMYB75L以及PavCHS、PavCHI、PavF3′H、PavDFR、PavANS、PavUFGT和PavGST等花青素相关基因的表达水平在14天和21天时均显著下降，表明PavUVR8沉默显著抑制了黄红色甜樱桃果实的红色着色。

PavUVR8在甜樱桃果实愈伤组织中的过表达促进花青素生物合成。研究人员构建了35S::PavUVR8过表达载体，并利用农杆菌EHA105转化“雷尼尔”黄红色甜樱桃果实来源的愈伤组织。两个独立的过表达株系（PavUVR8-OE-2和PavUVR8-OE-5）中PavUVR8转录水平显著高于野生型（wild type，WT）。在强光培养5天后，过表达愈伤组织呈红色，而WT愈伤组织仍呈黄色；且在光照后1天、3天和5天，过表达愈伤组织中的花青素含量均显著高于WT。同时，PavMYB75L以及PavCHS、PavF3′H、PavDFR、PavANS、PavUFGT和PavGST1等基因的表达水平在过表达愈伤组织中显著升高。

PavUVR8直接结合PavMYB75L、PavDFR和PavANS的启动子以激活转录。为解析PavUVR8调控花青素积累的分子机制，研究人员检测了PavUVR8对PavMYB75L、PavCHS、PavF3′H、PavDFR、PavANS、PavUFGT和PavGST启动子的影响。Y1H实验结果表明，PavUVR8可直接结合PavMYB75L、PavDFR和PavANS的启动子。ChIP-qPCR实验进一步证实，在PavUVR8-GFP过表达愈伤组织中，含有G-box基序（CACGTC/AACGTC）的PavMYB75L、PavDFR和PavANS启动子片段被特异性富集，表明PavUVR8在细胞内可直接结合这些启动子。双荧光素酶实验显示，与空载体对照相比，共表达35S::PavUVR8可显著提高Pro_PavMYB75L::LUC、Pro_PavDFR::LUC和Pro_PavANS::LUC报告基因的相对荧光素酶活性（LUC:REN），证明PavUVR8直接激活这些基因的表达。

讨论部分指出，光照是影响多种植物果实花青素生物合成的重要环境因素。自然UV-B辐射可通过调控花青素合成相关基因的表达和酶活性，增强叶片、花朵和果实中的花青素积累。前期研究表明，采后UV处理可增加甜樱桃的花青素含量及花青素合成相关基因的表达，提示存在一条独立的UV信号通路贡献于类黄酮和花青素生物合成，但其潜在分子机制尚未被全面表征。本研究确定，PavUVR8作为UV-B光受体，在甜樱桃果实中正向调控花青素生物合成。亚细胞定位结果显示，在强光条件下PavUVR8同时存在于细胞核和细胞质，而在黑暗条件下仅存在于细胞质。这与拟南芥中UVR8在没有UV-B辐射时主要定位于细胞质、经UV-B暴露后转位至细胞核的特性相似。进一步研究证实，PavUVR8通过直接结合MYB转录因子基因PavMYB75L和花青素生物合成相关基因PavDFR、PavANS的启动子来影响花青素积累，这一结果与其他植物中UVR8参与调控UV-B诱导花青素生物合成的研究发现一致。UVR8还被报道通过与WRKY36、BES1、BIM1以及E3泛素连接酶COP1等相互作用介导UV-B信号转导。在蔷薇科植物中是否存在类似的转录调控网络，协同调控光形态建成、类黄酮次生代谢和UV-B胁迫耐受性，值得进一步探索。

综上所述，通过PavUVR8沉默和过表达转基因分析，研究人员确定PavUVR8是一种正向调控甜樱桃果实花青素合成的UV-B光受体。PavUVR8可直接结合MYB转录因子基因PavMYB75L和花青素生物合成相关基因PavDFR、PavANS的启动子，激活其表达，进而增加花青素生物合成，最终导致果实着色。这些发现为全面阐明UV-B信号调控甜樱桃果实花青素生物合成的分子机制奠定了基础。