基于BeRST的超分子络合用于活细胞电压成像：环糊精主客体组装调控光物理性质与细胞亮度

《Biosensors》：Supramolecular Complexation of BeRST for Live-Cell Voltage Imaging

　　

电压敏感性荧光染料可实现跨膜电位（V_mem）的光学测量，但常受水溶性差、聚集以及细胞膜负载不完全等因素限制。本研究评估了超分子络合作为改善电压敏感性荧光团BeRST（Berkeley Red Sensor of Transmembrane potential）成像性能的策略。研究人员将BeRST与牛血清白蛋白（BSA）及结构各异的环糊精（CDs）进行络合，并评估了其在溶液相的光物理性质及活细胞荧光强度。主客体身份与浓度均影响BeRST发色团的局部环境，产生与聚集减少相一致的光谱变化。在HEK 293T细胞中，络合对平均细胞荧光强度的影响同样依赖于主体种类与浓度，所有受评估的主体在至少一种条件下均显著增强了平均细胞荧光强度。通过电压成像测定，络合态BeRST在活细胞中的电压敏感性与未络合BeRST相比保持不变。综上，这些发现表明CD络合可调控BeRST的光物理与细胞成像性质，同时保留其电压敏感性，支持将超分子络合作为改善亲脂性电压敏感性荧光染料递送与细胞亮度的策略。

研究背景方面，电压敏感性荧光染料（VSDs）能够对活细胞跨膜电位（V_mem）进行光学测量，是电生理学方法研究可兴奋系统的重要补充手段。此类探针的实用性不仅取决于电压敏感性，还取决于决定图像质量与细胞染色的固有性质，如荧光强度、光物理行为与膜定位能力。自20世纪70年代以来，电压敏感性染料已被用于光学记录神经元电活动，近期则发展了基于光诱导电子转移（PeT）机制实现V_mem可逆感知的电压敏感性荧光团（VF染料）。这类VF染料由发色团经高度共轭的分子导线连接至苯胺供体构成，分子导线部分的亲脂性促进其嵌入细胞膜。然而，这种疏水性可能限制水溶性并促进染料聚集，增加操作难度，并减少活细胞实验中可用的单体、可及膜染料数量，从而降低荧光强度与生物成像应用价值。超分子络合为解决上述局限提供了潜在策略。研究人员此前报道了BeRST的二乙基衍生物diEt BeRST，其电压敏感性较BeRST提高，但尽管其体外分子亮度更高，活细胞中细胞亮度却低于BeRST。使用非离子表面活性剂Pluronic F-127可改善diEt BeRST的细胞亮度，但未能达到BeRST水平；鉴于Pluronic F-127可能对细胞生理产生不良影响，研究人员评估了BSA作为BeRST与diEt BeRST的潜在载体，发现BSA络合改善了diEt BeRST的细胞荧光强度，但对BeRST作用有限。这些结果提示载体介导的增溶可影响VF染料的细胞性能，且结果取决于特定的VF-载体配对。本研究以广泛使用的BeRST为模型体系，重新审视BSA作为增溶剂的作用，并将该方法拓展至环糊精（CDs）——一类结构多样、空腔尺寸与化学取代可系统变化的小分子主体。CDs是由α-1,4-连接的吡喃葡萄糖亚基构成的水溶性环状寡糖，具有疏水内腔，可与疏水分子形成主客体复合物，从而改变客体分子的表观水溶性、聚集状态与局部化学微环境。CD络合效应取决于客体分子性质与CD主体身份。α-环糊精（α-CD，六个亚基）、β-环糊精（β-CD，七个亚基）与γ-环糊精（γ-CD，八个亚基）的空腔尺寸差异以及CD骨架的化学修饰可影响主客体相互作用的程度与特征，进而可能影响VF染料的光物理性质与细胞行为。CDs广泛用作药物辅料以改善疏水化合物的制剂与表观溶解度，并已成功用于DiSBAC₆(3)与di-8-ANEPPS等VSDs的递送，但其对基于PeT的VF染料的影响尚未被系统表征，特别是CD依赖的VF染料溶液光物理性质变化能否转化为细胞荧光强度改善仍不清楚。因此，本研究评估了与BSA及结构各异CDs的超分子络合如何影响基于PeT的VF染料BeRST的光物理性质与活细胞荧光强度。研究发现超分子络合以CD依赖方式改变BeRST的体外光物理性质与细胞荧光强度；尽管多种CD增强了BeRST在溶液中的吸光度或荧光，这些变化并未统一转化为细胞亮度提升；基于细胞场刺激实验，BeRST与CDs络合后保留电压敏感性。这些研究识别了可增强BeRST实际细胞亮度的CD条件，并将其效应置于BSA介导增溶的背景中；在所测条件中，磺丁基醚-β-环糊精（SBE-β-CD）在25:1的CD:VF摩尔比下使平均细胞荧光强度提升1.8倍，是改善BeRST活细胞实验性能的有前景的低浓度增溶剂。

研究人员开展研究所用主要关键技术方法包括：采用紫外-可见吸收光谱与荧光光谱（激发620 nm、发射700 nm）表征BeRST在杜氏磷酸缓冲盐溶液（DPBS）中与BSA及各类CD络合后的光物理性质，并以二氧六环-水介电常数系列作为参照评估发色团微环境极性；通过四参数逻辑回归拟合吸光度半高全宽（FWHM）等参数估算表观EC₅₀；在HEK 293T细胞（源自UC Berkeley细胞培养设施）中以500 nM BeRST加载并利用宽场落射荧光显微镜定量细胞荧光强度；采用细胞外场刺激（20 ms、80 V、2.5 Hz）结合共染参考染料VF2.1.Cl估算络合态BeRST的电压敏感性；并以台盼蓝排斥法评估细胞活力。

研究结果方面，第一，超分子络合对BeRST光物理性质的影响。研究人员检测了BeRST在DPBS中加与不加络合剂时的光物理性质，并以含0.1% SDS（w/w）的DPBS中BeRST参数作对照。含SDS时吸收光谱峰形尖锐；无SDS时吸收光谱展宽并红移，提示聚集。BeRST在DPBS（无SDS）中的吸收 максимум（λ_abs）较含SDS条件显著红移（659 nm至673 nm），绝对最大强度低3.5倍；无SDS时激发最大值为652 nm，相对吸收峰蓝移；发射最大值轻微蓝移（673 nm），绝对最大发射强度低5.6倍。与BSA络合后，吸收、激发与发射最大值相对含SDS条件均蓝移，绝对最大吸收与发射强度分别下降2.6倍与5.8倍，且BSA使发色团吸收峰相对无SDS条件变窄，提示水溶液中无去垢剂时BeRST形成聚集体。随后研究人员表征了β-CD、γ-CD及修饰CD（甲基-β-CD、2-HP-β-CD、SBE-β-CD）对BeRST光物理性质的影响，BeRST（1 μM）与各CD在1 μM–5 mM范围络合（β-CD因水溶性低仅评估至150 μM）。各CD浓度下激发与发射光谱基本不变，但吸收变化显著：与每种CD络合后吸收光谱均变窄、吸收强度增加，并伴随从673 nm至约656–659 nm的适度蓝移。为估算CD包封程度，研究人员将CD络合BeRST的吸收与二氧六环-水介电常数系列标准曲线比较；随介电常数升高，BeRST全局吸收最大值从643 nm移至670 nm，分子导线相关局部吸收最大值从420 nm轻微红移至425 nm，发射λ_em无明确方向性趋势而最大发射强度在最低与最高介电常数间总体下降77%。CD络合后发色团相关吸收带蓝移达17 nm，与发色团被包封于非极性CD空腔一致；而分子导线相关吸收带λ_abs变化极小且无明确方向性趋势。以吸收光谱变化估算BeRST:CD络合的表观EC₅₀，FWHM、FWHM处吸收强度及FWHM左右边缘均良好拟合四参数逻辑回归；SBE-β-CD使发色团相关吸收带变窄最有效（参数平均表观EC₅₀=200 μM），低于甲基-β-CD（450 μM）与2-HP-β-CD（625 μM）；除FWHM_abs左边缘外，2-HP-β-CD的FWHM_abs响应在最高测试浓度未达平台，其表观EC₅₀可能被低估。CD引起的吸收与发射强度变化不如吸收变窄效应稳健，但所得表观EC₅₀与FWHM_abs推导值一致；SBE-β-CD在较低浓度（100–500 μM）即产生可测光物理变化，低于甲基-β-CD（600–700 μM）与2-HP-β-CD（900–1300 μM）。第二，超分子络合对BeRST活细胞亮度的影响。研究人员比较了HEK 293T细胞以BSA或CD络合BeRST（500 nM，HBSS含0.5% DMSO）加载后的细胞膜染色，以未络合BeRST为参照；各主体与BeRST预先络合30 min后加载并定量细胞亮度。所有CD在其最优浓度下均使BeRST细胞亮度提升1.8×至2.1×，最优浓度因CD而异。各CD在12.5 μM（25:1 CD:BeRST摩尔比）下评估，并测试了更高浓度：β-CD（水溶性显著较低）评估至75 μM（150:1），其余CD至1 mM（2000:1）；SBE-β-CD在250 μM与1 mM时导致细胞从盖玻片脱落，故未评估高于12.5 μM的浓度。不同CD浓度效应各异：β-CD最有效浓度为75 μM（提升1.8倍），γ-CD为12.5 μM（1.8倍），甲基-β-CD为1 mM（2.0倍），2-HP-β-CD为250 μM（2.1倍），SBE-β-CD为12.5 μM（1.8倍）；不同浓度间无明确趋势，部分CD（如γ-CD）在低浓度最佳，另一些（2-HP-β-CD、甲基-β-CD）在中高浓度最佳。β-CD、甲基-β-CD、2-HP-β-CD、SBE-β-CD与γ-CD被选用于进一步场刺激评估。第三，超分子络合对BeRST活细胞电压敏感性的影响。所有BeRST与β-CD、甲基-β-CD、2-HP-β-CD、SBE-β-CD或γ-CD的复合物在HEK 293T细胞中均保留与未络合BeRST相当的电压敏感性，络合条件平均响应约为31% ΔF/F₀每100 mV（与图2中所用CD浓度相同），其他CD浓度评估结果一致；该响应与既往经膜片钳电生理测得的未络合BeRST电压敏感性（30% ± 1% ΔF/F₀每100 mV，均值±S.E.M.）相符。为评估电压敏感性，各络合BeRST条件与电压敏感性染料VF2.1.Cl在HEK 293T细胞中共孵育后行场刺激；VF2.1.Cl的ΔF/F₀已由膜片钳电生理确定，用作参考染料，比较BeRST与VF2.1.Cl响应可估算络合BeRST的ΔF/F₀。BeRST与CDs处理对细胞活力无影响：经BeRST或CD络合BeRST处理的细胞活力为95%，与仅DMSO（95%）或未处理（95%）相当，而去垢剂SDS（0.01%）处理组活力约11%；尽管高浓度（mM）长时间（小时）使用甲基-β-CD可提取膜胆固醇，但在本加载条件下未观察到细胞活力改变。

讨论与结论部分，本研究确立了CD超分子络合作为改善VF染料BeRST细胞亮度的可行策略。CD络合对BeRST光物理性质的影响取决于主体身份与浓度；提高CD浓度通常增加BeRST绝对吸收与发射强度并使发色团吸收带变窄，而分子导线相关吸收带仅轻微变化，提示CD络合可改变BeRST发色团局部环境并与聚集减少一致。SBE-β-CD在相对较低浓度下即有效产生溶液相光谱变化。包括所有受评估修饰β-CDs在内的多种CD条件增强了细胞荧光强度。总体上，这些结果强调在溶液与细胞环境中同时评估染料性能的重要性，并提示超分子络合可在维持电压敏感性的同时改善含亲脂性分子组件电压敏感性染料的水相分散与亮度，支持使用修饰β-CDs优化BeRST活细胞成像性能，其中12.5 μM SBE-β-CD是提升BeRST活细胞成像亮度的有前景低浓度条件。CD络合BeRST的细胞成像进一步表明溶液相效应可转化为细胞荧光强度增加，但增强幅度取决于主体与络合条件；在所测条件中，250 μM 2-HP-β-CD使平均细胞荧光强度增幅最大，约为未络合BeRST的2.1倍；SBE-β-CD产生相似的1.8倍细胞荧光增强，但浓度低20倍（12.5 μM）；甲基-β-CD亦产生一致的强增强；尽管SBE-β-CD平均增强小于250 μM 2-HP-β-CD，两种条件间无显著差异；β-CD、γ-CD及所测单一BSA条件改善较为温和；尽管SBE-β-CD在相对低浓度产生显著溶液相光谱变化，细胞结果未识别出在所有比较中统一最优的单一CD，提示支配BeRST溶液行为的因素与支配细胞荧光强度的因素并不完全相同。尤为值得注意的是，所选CD条件络合未损害BeRST电压敏感性；所有测试的络合条件在以已知标准归一化的场刺激方案中均保留与未络合BeRST相当的响应，络合条件平均电压敏感性约为31% ΔF/F₀每100 mV，与既往膜片钳电生理测得的未络合BeRST电压敏感性（30% ± 1% ΔF/F₀每100 mV，均值±S.E.M.）相符；因此，所选CD复合物细胞荧光强度的增加是在保留BeRST报告膜电位能力的同时实现的。未来研究应评估更广泛的染料-主体组合（包括其他VoltageFluor染料），以确定络合BeRST所观察到的效应是否可推广至结构相关的电压敏感性染料；还应开展同步膜片钳电生理与荧光成像以验证CD络合染料的电压敏感性；此类研究亦可确定此处的荧光增强能否转化为在生理更复杂的神经元制备（不同于永生化细胞系）中改善的膜标记与电压成像。研究结论为：本研究确立了CD超分子络合作为改善VF染料BeRST细胞亮度的可行策略；CD络合对BeRST光物理性质的影响取决于主体身份与浓度；SBE-β-CD在相对低浓度下即可有效产生溶液相光谱变化；包括所有受评估修饰β-CDs在内的多种CD条件增强了细胞荧光强度；这些结果强调在溶液与细胞环境中同时评估染料性能的重要性，并提示超分子络合可改善含亲脂性分子组件电压敏感性染料的水相分散与亮度，同时维持电压敏感性；研究结果支持使用修饰β-CDs优化BeRST活细胞成像性能，其中12.5 μM SBE-β-CD是提升BeRST活细胞成像亮度的有前景低浓度条件。