原发前列腺癌中PTEN缺失、mTORC1特征与CAD表达：蛋白水平数据及ERG融合的作用

《Cells》：PTEN Deletion, mTORC1 Signatures and CAD Expression in Primary Prostate Cancer: Protein-Level Data and the Role of ERG Fusion

　　

该探索性公共数据分析检验了原发前列腺癌中的PTEN（phosphatase and tensin homolog，磷酸酶与张力蛋白同源物）缺失是否与CAD（carbamoyl-phosphate synthetase II–aspartate transcarbamoylase–dihydroorotase，氨甲酰磷酸合成酶II–天冬氨酸转氨甲酰酶–二氢乳清酸酶）、mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1，雷帕霉素机制靶点复合物1）和嘧啶合成表达相关，以及这些关联能否经受蛋白水平和混杂因素分析。PTEN缺失激活PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase，磷脂酰肌醇3-激酶）–AKT（protein kinase B，蛋白激酶B）信号，mTORC1通过S6K1（ribosomal protein S6 kinase 1，核糖体蛋白S6激酶1）介导的CAD磷酸化刺激嘧啶合成。在来自TCGA-PRAD（The Cancer Genome Atlas Prostate Adenocarcinoma，癌症基因组图谱前列腺腺癌）的485例原发肿瘤（159例PTEN缺失）中，缺失与较高的CAD mRNA（Hedges’ g = 0.57）和较高的Hallmark mTORC1评分（g = 0.54）相关。在342例具有RPPA（reverse-phase protein array，反相蛋白阵列）数据的肿瘤中，缺失伴随较低的PTEN蛋白和较高的AKT Ser473磷酸化，但未伴随预先指定的mTORC1磷酸化输出复合评分升高（g = ?0.02），该复合评分本身与转录评分不相关。在加入纯度、TP53、RB1、ERG融合和批次的预先指定模型（n = 276）中，PTEN–CAD关联不存在（β = ?0.002；p = 0.96），而mTORC1评分关联持续存在。在事后分解中，与PTEN缺失共现的ERG融合（odds ratio 3.6）最改变系数。跨八个队列，小的PTEN mRNA–CAD关联（g = 0.23）在ERG校正后减弱至0.14，置信区间重叠（Hartung–Knapp p = 0.071）。批量肿瘤通路特征和PTEN–CAD关联需要蛋白水平和ERG感知的解释。

研究背景与目的：前列腺癌是男性常见诊断癌症和癌症死亡原因之一，治疗抵抗仍是临床问题。PTEN在20–40%原发前列腺肿瘤中缺失或突变，晚期更常见；PTEN缺失解除对PI3K–AKT–mTORC1–S6K1–CAD Ser1859轴的约束，从而刺激嘧啶合成。然而，人类前列腺肿瘤中PTEN状态与CAD及嘧啶合成程序表达是否系统相关尚未被检验。公共数据转录组通路研究存在两个问题：转录“活性”特征是对bulk mRNA的统计摘要，未必反映实测信号；PTEN缺失与TMPRSS2–ERG融合共现，任何与ERG融合相关的转录本都可能看似与PTEN缺失相关。为此，研究人员开展探索性、假设生成研究，检验PTEN状态与CAD、mTORC1和嘧啶合成表达的关联，并考察蛋白水平和混杂因素；假设若PTEN缺失经PI3K–AKT–mTORC1增加CAD，则PTEN缺失肿瘤应有更高CAD mRNA和更高实测mTORC1输出，且独立于共现基因组改变。研究意义在于将转录关联与蛋白测量及基因组背景对照，提示bulk通路特征和PTEN–CAD关联需蛋白水平和ERG感知解释；研究不涉及临床可操作性。

关键技术方法：分析八套前列腺癌转录组队列：TCGA-PRAD和7个GEO系列（GSE21034、GSE6919、GSE35988、GSE46602、GSE70770、GSE55945、GSE32571）。TCGA-PRAD采用RSEM表达、GISTIC2拷贝数、GDC counts、cBioPortal RPPA、MC3突变、ABSOLUTE纯度、ERG融合、TP53/RB1状态和批次；MSKCC队列（Taylor等；与GSE21034同患者）作非TCGA基因组队列。用GSVA（基因集变异分析）评分HALLMARK_MTORC1_SIGNALING（去RRM2）和de novo嘧啶合成集；limma-voom差异表达；RPPA预设mTORC1磷酸化输出复合评分；多变量OLS模型M1–M6；metafor跨队列Meta分析；GSE138417（MCF7，MLN0128）药理学对照。

研究结果：
3.1 肿瘤与正常组织差异表达：TCGA-PRAD全基因组limma-voom比较肿瘤与正常前列腺，236个基因下调、98个上调；PTEN最显著下调（log₂FC = ?1.51；FDR = 4.3×10^?62），CAD mRNA轻度升高（log₂FC = +0.23；FDR = 1.4×10^?4），核心PI3K–AKT–mTOR激酶转录本变化小。通过差异表达研究得出肿瘤中PTEN显著下调、CAD轻度升高的结论。
3.2 PTEN缺失与CAD、mTORC1和嘧啶合成表达（原始分析）：PTEN缺失肿瘤较CN-neutral肿瘤CAD mRNA更高（Hedges’ g = 0.57）、mTORC1评分更高（g = 0.54）、嘧啶合成评分更高（g = 0.49）；两评分相关（r = 0.51）；深、浅缺失无显著差异；突变感知定义下关联不变；CAD拷贝数加入模型不改变PTEN系数。通过对比和评分分析得出PTEN缺失与三者转录关联。
3.3 临床和增殖协变量校正（原始分析）：M1–M4校正年龄、ISUP grade group、pT、增殖和AR活性后，CAD系数从0.236降至0.173，mTORC1评分基本不变（0.51至0.48），嘧啶关联大多由增殖解释（0.46至0.18）。通过多变量模型得出CAD关联部分减弱、mTORC1关联稳健、嘧啶特征像增殖标志。
3.4 蛋白水平读数（预先指定）：342例RPPA肿瘤中，PTEN缺失者PTEN蛋白低（g = ?0.46）、AKT pSer473高（g = 0.32）；预设mTORC1磷酸化输出复合评分无差异（g = ?0.02）；六个输出磷酸抗体无显著升高，p70S6K pThr389名义更低（g = ?0.26；FDR = 0.097）；转录评分与磷酸输出评分不相关（r = 0.02），CAD mRNA亦不相关（r = 0.08）；连续PTEN蛋白与磷酸输出负相关（r = ?0.25）；其他mTORC1/SREBP相关基因集无FDR < 0.05关联。通过蛋白水平分析得出基因组分类有蛋白支持，但无实测mTORC1输出升高。
3.5 基因组背景校正与ERG融合作用（预先指定，附事后分解）：M6（n = 276）中PTEN–CAD关联消失（β = ?0.002；p = 0.96；同子集M4 β = 0.127；p = 0.009），无批次结果相同；mTORC1评分关联不变（β = 0.145；p = 1.8×10^?6），嘧啶关联边缘（β = 0.077；p = 0.048）。事后分解显示ERG融合最改变系数：PTEN缺失肿瘤ERG融合阳性67%对36%（OR = 3.6），ERG阳性肿瘤CAD更高（g = 0.61）；M4加ERG融合单独使系数降至0.036（p = 0.46），纯度、TP53/RB1、批次改变小；ERG分层内校正后无关联；mTORC1关联在两分层均存在；ERG mRNA作为代理AUC 0.997，全部478例加入ERG mRNA后系数由0.173降至0.078（p = 0.067）。通过预指定混杂模型和事后分解得出PTEN–CAD不独立于ERG融合及临床/增殖协变量。
3.6 非TCGA基因组队列（预先指定）：MSKCC队列109例原发肿瘤、13例PTEN缺失，点估计同向但不显著：CAD g = 0.35（p = 0.28）、mTORC1 g = 0.22、嘧啶g = 0.27；Gleason校正CAD β = 0.027（p = 0.69），样本少、结论不确定。通过非TCGA队列复制分析得出点估计同向但不显著。
3.7 跨队列PTEN mRNA分析（原始分析）及ERG校正（事后）：八队列按PTEN mRNA中位分层，原发肿瘤主分析CAD在PTEN-Low对PTEN-High g = 0.227（Wald p = 0.0039；Hartung–Knapp p = 0.026；I² = 21.7%）；留一法在Hartung–Knapp下失去名义显著；PTEN–CAD相关r = ?0.158（p = 0.023）；ERG mRNA校正后g由0.231降至0.144（Hartung–Knapp p = 0.071），约降38%，CI重叠；GSE32571 ERG不可测，排除后0.136（p = 0.12）。通过跨队列Meta分析得出小关联且ERG校正后减弱。
3.8 无进展间期（预先指定）和药理学对照（原始分析）：482例、90事件、中位随访30.9月中，未校正PTEN缺失HR = 1.56（p = 0.037）、CAD mRNA HR = 1.44/SD（p = 9.2×10^?4）、嘧啶评分HR = 1.49/SD（p = 2.7×10^?4）与较短PFI相关；校正grade group和pT后均不显著；mTORC1评分无关联。MCF7中MLN0128降低嘧啶合成转录本（cytosolic p = 4.3×10^?4；polysome p = 1.7×10^?3；无翻译成分p = 0.98），CAD不变。通过Cox和药理学对照得出生存关联不独立、mTOR抑制降低嘧啶转录本但CAD不变。

讨论总结：讨论部分提出三点。第一，基因组PTEN分类获蛋白水平支持：PTEN缺失肿瘤PTEN蛋白低、AKT Ser473磷酸化高，PTEN mRNA与蛋白相关。第二，PTEN缺失与Hallmark mTORC1转录评分关联对grade、stage、增殖、AR活性、纯度、TP53、RB1、ERG融合和批次稳健，但无实测mTORC1输出升高；S6K1、S6、4E-BP1磷酸化未显著升高，转录评分与磷酸输出复合评分不相关，其他mTORC1相关基因集无关联。作者讨论可能解释包括RPPA测bulk裂解物单时间点、磷酸化离体不稳定、mTORC1整合PTEN–AKT以外输入、Hallmark集含响应其他转录程序的生物合成基因；因此该转录评分不应描述为这些肿瘤的mTORC1活性；探索性连续PTEN蛋白与磷酸输出负相关提示PTEN蛋白水平可能比拷贝数更接近mTORC1输出，需更丰富蛋白数据检验。第三，PTEN缺失与CAD mRNA关联不独立于ERG融合加grade、stage和增殖；PTEN loss富集于ERG融合阳性，ERG融合肿瘤CAD高；作者将ERG融合视为共同原因而非中介，因TMPRSS2–ERG一般早期常truncal，在同时携带两种改变的肿瘤中ERG融合先于PTEN缺失；若ERG在下游，校正会移除部分真实效应，但这些数据不能检验事件顺序；ERG融合单独非完全解释，分层内校正前CAD仍高g≈0.4，只有加临床和增殖协变量后消失；TCGA-PRAD检测不到PTEN–CAD，跨队列PTEN-Low效应约降38%至小估计，Hartung–Knapp不显著；原问题未获支持；不排除CAD磷酸化效应或低于分辨率的ERG独立小效应；嘧啶特征像增殖标志；未校正生存关联校正grade/stage后不存。一般教训：肿瘤抑制因子与下游转录本关联可来自共现基因组事件；通路“活性”特征可与基因型强关联而无实测通路输出差异；蛋白水平检查和共现驱动事件校正可实质改变解释。局限性：观察性探索公共数据不能因果；RPPA无CAD/pCAD(Ser1859)；Supplementary Note S1 Western blots为单次实验、无 viability/PTEN测量、非PTEN-loss模型、不贡献结论；融合、纯度、批次仅TCGA 2015子集，ERG mRNA代理；ERG分析事后；分析子集非随机（RPPA子集pT3–T4更多68%对45%；M6子集PTEN缺失38%对26%且CAD mRNA更高；TCGA 2015 grade group略差异p = 0.044）；非TCGA队列仅13例PTEN缺失且与GSE21034同患者；GSE32571 ERG不可测；跨队列用PTEN mRNA代理且主分析指定事后；Sinha等蛋白队列和细胞系dependency数据未获得。未来方向：用同源PTEN-proficient/deficient前列腺模型有/无ERG表达测pCAD(Ser1859)和同位素示踪嘧啶合成；有质谱蛋白组和融合状态的前列腺肿瘤队列检查CAD蛋白；超出本研究范围。

研究结论翻译：在原发前列腺癌中，PTEN缺失反映为较低的PTEN蛋白和较高的AKT Ser473磷酸化，并与Hallmark mTORC1转录特征稳健相关，但与实测mTORC1磷酸化输出无关。在TCGA-PRAD中，PTEN缺失与CAD mRNA的关联不独立于共现的ERG融合以及grade、stage和增殖；ERG融合是加入后最改变该关联的协变量；跨队列PTEN mRNA–CAD关联在ERG校正后减弱为小估计，在Hartung–Knapp推断下不显著。CAD蛋白、CAD磷酸化和嘧啶通量未测量，这些发现不意味着临床可操作性。