《Cells》：Comprehensive Proteomics Reveals Pachymic Acid Targeting RBMX via hnRNPC Degradation in Colorectal Cancer
编辑推荐：
茯苓酸（Pachymic acid, PA）为茯苓（Poria cocos）的主要生物活性成分，通过破坏糖酵解抑制结直肠癌（colorectal cancer, CRC）的增殖和侵袭。然而，其体内外抗肿瘤活性及潜在机制仍不明确。RNA结合蛋白（RNA-bind
茯苓酸（Pachymic acid, PA）为茯苓（Poria cocos）的主要生物活性成分，通过破坏糖酵解抑制结直肠癌（colorectal cancer, CRC）的增殖和侵袭。然而，其体内外抗肿瘤活性及潜在机制仍不明确。RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）是CRC中关键的转录后调控因子，但其作用机制和潜在治疗价值仍知之甚少。本研究采用限制性蛋白水解-质谱（limited proteolysis-mass spectrometry, LiP-MS），一种无需预先化学修饰的靶点去卷积方法，在复杂蛋白质组范围内描绘PA处理细胞后蛋白质构象的变化。研究结果揭示，RNA结合基序蛋白X连锁（RBMX）作为PA的靶点，并发生浓度依赖性构象改变，这一发现获得了体外和体内结合验证及功能实验的支持。此外，邻近标记-质谱（proximity-labeling mass spectrometry, PL-MS）分析显示，RBMX与异质性核核糖核蛋白C（hnRNPC）相互作用。功能实验表明，PA处理诱导RBMX依赖性的hnRNPC降解，从而抑制CRC细胞增殖和肿瘤生长。综上，本研究通过LiP-MS将RBMX鉴定为PA的分子靶点，为PA介导的CRC抑制机制提供了新见解，并强调RBMX–hnRNPC轴是其抗肿瘤效应的重要介导因子。
结直肠癌（CRC）是一种高发的消化道恶性肿瘤，尽管治疗手段不断进步，但长期生存患者仍面临治疗相关并发症和生活质量下降等问题，亟需明确作用机制的新靶点与新策略。在中医理论中，湿邪、痰浊与热毒互结可形成癥积，促进肿瘤发展；茯苓（Poria cocos）作为健脾渗湿、化痰之要药，被用于CRC的辅助治疗。茯苓酸（Pachymic acid, PA）是茯苓中主要的三萜类活性成分，已被报道可抑制CRC细胞增殖与侵袭，但其直接蛋白靶点及精确分子机制尚未阐明。RNA结合蛋白（RBPs）在CRC的转录后调控中发挥重要作用，但相关治疗潜力研究不足。基于此，研究人员采用无需化学修饰的限制性蛋白水解-质谱（LiP-MS）技术，在全蛋白质组水平上对PA的靶点进行无偏筛选，并系统解析其抗CRC的分子机制。
研究人员通过LiP-MS鉴定出RBMX（RNA结合基序蛋白X连锁）为PA的结合靶点，PA处理可诱导RBMX发生浓度依赖性构象变化并提高其蛋白稳定性。结合邻近标记-质谱（PL-MS）分析，发现RBMX与异质性核核糖核蛋白C（hnRNPC）存在相互作用。功能实验表明，PA通过稳定RBMX促进hnRNPC降解，从而抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭，并减少体内肿瘤生长。该研究揭示了PA–RBMX–hnRNPC调控轴，为PA的抗CRC作用提供了新的机制解释，也为靶向RBP的肿瘤治疗策略提供了新思路。
研究所用的主要关键技术方法包括：限制性蛋白水解-质谱（LiP-MS）用于鉴定PA的蛋白靶点；APEX2邻近标记-质谱（PL-MS）用于绘制RBMX相互作用网络；分子对接与分子动力学模拟预测结合模式；细胞热位移分析（CETSA）、药物亲和响应靶点稳定性分析（DARTS）和表面等离子体共振（SPR）验证PA与RBMX的直接结合；免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光验证蛋白相互作用；稳定敲低细胞系和功能实验评估表型变化；原位结直肠癌小鼠模型（使用CT26-luc细胞，来自广州中医药大学）评价体内药效。细胞系RKO、HCT116、293T、HCoEpiC、HepG2、MCF-7、A375和HeLa均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
结果部分：
3.1 PA在体内外表现出抗肿瘤活性：细胞活力、克隆形成、Transwell迁移和侵袭实验显示，PA对CRC细胞HCT116和RKO具有选择性抑制作用，且呈剂量依赖性；原位CRC小鼠模型中，PA（20、40 mg/kg）显著降低肿瘤体积和重量，H&E染色显示肿瘤组织出现坏死、细胞密度降低等病理改变，且PA组小鼠体重无明显下降，器官指数变化轻微，提示PA体内耐受性较好。
3.2 RBMX对PA的药理功效至关重要：LiP-MS分析显示，PA以剂量依赖性方式改变大量蛋白质丰度，其中RBMX的丰度变化倍数具有显著剂量依赖性；FASP标记定量蛋白质组学发现RBMX在CRC细胞系中低表达，PA处理后其蛋白水平升高，结合富集分析将RBMX确定为首选候选靶点。
3.3 PA结合RBMX的RRM结构域：分子对接显示PA与RBMX结合亲和力为?7.2 kcal/mol，分子动力学模拟进一步验证复合物稳定性并计算结合自由能为?34.60 kcal/mol；CETSA和DARTS实验证实PA增强RBMX的热稳定性和抗蛋白酶降解能力；SPR测定PA与RBMX N端RRM结构域（T1片段）的KD为42.9 μM，远低于阴性GST蛋白的436 μM，证明PA特异性结合RBMX的RRM域。
3.4 PA通过RBMX抑制CRC进展：KM-plotter和HPA数据库分析显示RBMX高表达与CRC患者更长的总生存期和无复发生存期相关，且RBMX在CRC细胞系中低表达；PA处理提高RBMX蛋白水平而不影响mRNA水平，CHX追踪实验表明PA延长RBMX蛋白半衰期；RBMX敲低后CRC细胞迁移和侵袭能力增强，提示RBMX是肿瘤抑制因子。
3.5 RBMX与hnRNPC的相互作用：APEX2-PL-MS鉴定出hnRNPC、hnRNPM等多个RBMX相互作用蛋白，其中hnRNPC富集倍数较高；免疫荧光显示RBMX与hnRNPC在核内高度共定位，Co-IP实验验证两者物理结合，但它们互不调节彼此的蛋白水平。
3.6 hnRNPC促进CRC进展：KM-plotter数据库显示hnRNPC高表达与CRC患者较差的生存相关；TCGA联合分析发现“高RBMX/低hnRNPC”表达特征与最佳生存相关；hnRNPC在CRC细胞系中高表达，敲低hnRNPC显著降低细胞活力、增殖、迁移和侵袭能力，提示hnRNPC发挥促癌作用。
3.7 PA通过诱导hnRNPC降解抑制CRC：PA以剂量依赖性方式降低hnRNPC蛋白水平，CHX实验显示PA缩短hnRNPC半衰期，而RBMX敲低可逆转该效应；qPCR显示hnRNPC mRNA无明显变化，CETSA和DARTS不支持PA与hnRNPC直接结合；hnRNPC过表达可部分逆转PA对CRC增殖的抑制。PA处理增加细胞整体泛素化水平，并促进hnRNPC的泛素化；蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂HCQ、Baf-A1均可减弱PA诱导的hnRNPC降解。PA还降低p62水平并增加LC3-II，增强自噬流，RFP-EGFP-LC3双荧光报告系统进一步证实PA促进自噬体-溶酶体融合及降解。
讨论部分指出，RBMX和hnRNPC均属于RBP家族，在转录后调控和肿瘤进展中发挥关键作用；PA通过稳定RBMX进而促进hnRNPC降解，该过程涉及泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬-溶酶体途径（ALP），代表了一种新型的“药物结合一个RBP诱导另一个RBP降解”的机制。研究同时存在局限性，如PA与RBMX的体外结合亲和力较弱、缺乏竞争实验验证、缺少自噬相关基因（如ATG5/ATG7）的遗传学验证，以及需要独立临床样本进一步验证该轴的临床意义。
研究结论部分翻译如下：在本研究中，通过整合全局蛋白质组学与无标记LiP-MS，研究人员将RBMX鉴定为PA的潜在蛋白靶点。PA处理部分恢复了CRC细胞中RBMX的蛋白丰度。此外，基于RBMX-APEX2的PL-MS鉴定出hnRNPC、hnRNPL、hnRNPM和hnRNPU为与RBMX相互作用组密切相关的RBPs。hnRNPC在CRC中高表达，并与患者生存呈负相关。广泛的体内外分析表明，PA在不显著影响hnRNPC mRNA水平的情况下降低其蛋白水平，提示PA在翻译后水平促进hnRNPC降解。此外，药理学抑制蛋白酶体或ALP均可减弱PA诱导的hnRNPC降解，表明UPS和ALP均参与该过程。综上所述，这些发现支持以下模型：PA与RBMX结合促进RBMX稳定，并伴随hnRNPC降解的增强，从而有助于抑制CRC进展。
