《Cells》：Kindlin-1 Links Integrins and Maintenance of Nuclear Shape in Cutaneous Squamous Carcinoma Cells
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Kindlin家族蛋白是整合素激活和机械应答的关键分子。在表皮中，编码Kindlin-1的FERMT1基因的遗传性功能缺失突变会增加皮肤鳞状细胞癌（cSCC）的发病风险。值得注意的是，Kindlin-1在表皮肿瘤中的作用此前几乎未被探索。在本研究中，研究人员分
Kindlin家族蛋白是整合素激活和机械应答的关键分子。在表皮中，编码Kindlin-1的FERMT1基因的遗传性功能缺失突变会增加皮肤鳞状细胞癌（cSCC）的发病风险。值得注意的是，Kindlin-1在表皮肿瘤中的作用此前几乎未被探索。在本研究中，研究人员分析了cSCC细胞模型中FERMT1失活的后果。Kindlin-1缺失的细胞表现出黏着斑（focal adhesions）数量和尺寸的减少，以及肌动蛋白应力纤维（actin stress fibres）和F-肌动蛋白核周帽（F-actin perinuclear cap）的改变。显著的是，FERMT1失活还导致核体积（nuclear volume）和总表面积（total surface area）的减小。这些异常并不能通过外源性表达Kindlin-2或无法结合整合素的Kindlin-1突变体来改善。相比之下，在Kindlin-1缺陷细胞中，组成性激活的RhoA蛋白能够恢复核尺寸。这些发现与以下观点一致：Kindlin-1在介导整合素信号和RhoA激活以调节核周肌动蛋白丝和核形态中发挥重要作用。
论文解读
一、研究背景与目的
细胞持续感知并响应来自细胞外环境和细胞内张力的机械信号，这一过程涉及多种机制。其中一条主要的机械转导轴由整合素与细胞外基质（ECM）的相互作用、黏着斑的形成、肌动蛋白细胞骨架的调节以及下游细胞应答的激活构成。细胞核同样是感知和响应机械力学的关键元件，核形态的变化与基因表达调控、细胞行为及表型密切相关。Kindlin家族蛋白是整合素黏附体（integrin adhesome）的重要组成，在整合素激活和黏着斑组装的早期阶段被招募。在表皮角质形成细胞中，Kindlin-1与β1和β6整合素结合，调节表皮生长因子受体信号、内体循环、氧化还原平衡及与ECM的黏附。编码Kindlin-1的FERMT1基因的遗传性功能缺失突变可导致表皮脆性、水疱形成、光敏感、萎缩、慢性皮肤炎症以及皮肤鳞状细胞癌（cSCC）发病率的升高。
尽管Kindlin-1在非转化表皮角质形成细胞中的作用已被广泛研究，但其在cSCC中的功能几乎未被探索。cSCC是常见的具有高转移潜能的癌症，紫外线照射、免疫抑制和慢性炎症是其主要病因。在遗传性大疱性疾病患者中，慢性炎症导致ECM异常、纤维化、组织硬化及通过整合素介导的异常机械信号。散发性cSCC肿瘤相对邻近正常组织也表现出更高的硬度，促进肿瘤细胞增殖和组织侵袭。基于此，研究人员开展了本研究，旨在探究FERMT1失活对人cSCC细胞肌动蛋白细胞骨架和核形态的影响。
二、主要技术方法
研究人员使用了人面部表皮鳞状细胞癌来源的SCC-13细胞系（源自一位56岁女性患者，该患者术前接受了新辅助放疗）。通过CRISPR/Cas9介导的FERMT1基因编辑，研究人员生成了两个独立的Kindlin-1缺陷单克隆细胞系（KO1和KO2）。研究采用了免疫印迹分析验证Kindlin-1蛋白的缺失；免疫荧光结合共聚焦显微镜用于观察黏着斑（以磷酸化桩蛋白免疫反应性标记）、F-肌动蛋白（以荧光标记的鬼笔环肽标记）和核被膜（以lamin A/C抗体标记）；利用Fiji软件及NucleusJ 2.0插件对黏着斑数量与面积、核体积与总表面积进行定量分析；通过自定义图像分析流程量化核上F-肌动蛋白荧光面积；使用Manders'重叠系数分析lamin A/C与SUN1的共定位模式。此外，研究人员通过外源性表达野生型或突变型Kindlin-1、Kindlin-2蛋白，以及组成性激活或显性负性的Rho家族GTPase突变体，探究相关信号通路的作用。
三、研究结果
3.1 FERMT1功能性失活改变SCC13细胞中的黏着斑
研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑生成了两个Kindlin-1缺陷的SCC13单克隆细胞系（KO1和KO2），并通过免疫印迹验证了Kindlin-1蛋白的缺失。在四细胞细胞岛中，亲本细胞的黏着斑数量为92 ± 11.3，约为KO1和KO2细胞的3至4倍（分别为31 ± 5.06和22.2 ± 3.59）。单个黏着斑的表面积在亲本细胞中为0.677 ± 0.022 μm2，显著大于KO1和KO2细胞（分别为0.516 ± 0.021 μm2和0.448 ± 0.013 μm2）。外源性表达野生型（WT）Kindlin-1可恢复KO细胞中黏着斑的数量和面积至亲本细胞水平，而无法结合整合素的Kindlin-1突变体（W612A）则不能恢复。外源性表达野生型Kindlin-2仅能部分恢复KO细胞中黏着斑的丰度和面积，而无法结合整合素的Kindlin-2突变体（W615A）在亲本细胞中反而导致黏着斑数量和面积的显著减少。这些结果表明，Kindlin-1有效调节SCC13细胞黏着斑的能力依赖于其与β整合素胞质尾部的结合，且Kindlin-2无法完全替代Kindlin-1的功能。
3.2 Kindlin-1缺陷SCC13细胞中F-肌动蛋白和微管网络的改变
在亲本细胞中，可观察到横跨胞体的应力纤维、平行于质膜的周边F-肌动蛋白束以及核周F-肌动蛋白环。而在大多数KO1和KO2细胞中，应力纤维无法检测到，核周F-肌动蛋白环显著减少或缺失。研究人员进一步量化了核上区域（supranuclear region）的F-肌动蛋白荧光面积，发现亲本细胞中该区域荧光面积占核总面积的19.3% ± 1.4%，而KO1和KO2细胞中仅为4.6% ± 0.77%和3.3% ± 0.55%。此外，KO细胞的微管呈现紊乱、交叉或缠结的模式，单个微管排列较差且在质膜附近区域常发生弯曲。这些观察表明Kindlin-1在F-肌动蛋白应力纤维和核上肌动蛋白丝（可能包括核周肌动蛋白帽）的组装和/或维持中发挥关键作用，并可能对微管在整合素黏着斑处的捕获也很重要。
3.3 缺乏Kindlin-1时核形态和核被膜的改变
通过分析lamin A/C免疫反应性的共聚焦z-stack，研究人员发现亲本细胞的核体积（953 ± 22.7 μm3）显著大于KO1和KO2细胞（分别为733 ± 20.6 μm3和703 ± 18.5 μm3）。同样，亲本细胞的核总表面积（546.6 ± 10.6 μm2）也大于KO细胞（分别为450 ± 9.7 μm2和423 ± 8.5 μm2）。在SUN1与lamin A/C的共定位分析中，亲本细胞中lamin A/C与SUN1重叠的分数（M2系数）为0.51 ± 0.01，与KO细胞（0.49 ± 0.01和0.48 ± 0.01）相似。然而，亲本细胞中SUN1与lamin A/C共定位的分数（M1系数）为0.55 ± 0.01，而在KO1和KO2细胞中显著升高（均为0.65 ± 0.01）。这些结果表明Kindlin-1对维持正常核形态至关重要，且其缺失可能改变SUN1与lamin A/C在SCC13细胞核中的空间关系。
3.4 Kindlin-1完整的整合素结合域是维持核尺寸所必需的
外源性表达野生型Kindlin-1可恢复KO1和KO2细胞中核体积和表面积至与亲本细胞相当的水平，而表达整合素结合缺陷的Kindlin-1 W612A突变体则无法恢复这些核形态异常。野生型Kindlin-2仅能部分恢复KO细胞的核尺寸，而Kindlin-2 W615A突变体在亲本或KO细胞中均不改变核体积和表面积。这些结果进一步证实Kindlin-1在SCC13细胞中作为连接整合素和黏着斑与核尺寸维持的机械调控通路中的关键组分，且Kindlin-2不能完全替代其功能。
3.5 活性RhoA参与核形态的维持
研究人员外源性表达了组成性激活的RhoA（G14V）、Cdc42（G12V）和Rac1（G12V）突变体。在KO1和KO2细胞中表达RhoA G14V可将核体积和表面积恢复至与亲本细胞相当的水平。而表达Cdc42 G12V或Rac1 G12V则导致核体积和表面积显著减小，并形成不规则形状和/或分叶状核，这与Kindlin-1的存在与否无关。核圆度分析显示，RhoA G14V表达可使KO细胞的核圆度恢复至亲本细胞水平，而Cdc42 G12V和Rac1 G12V则导致圆度值显著降低且分布更广。进一步的实验表明，在亲本细胞中表达显性负性RhoA（T19N）可显著降低核体积和表面积至与KO细胞相当的水平，而野生型RhoA无此效应。在KO细胞中，野生型和T19N RhoA均无显著影响，而G14V RhoA仍能恢复核尺寸。这些结果表明Kindlin-1和RhoA共同调节SCC13细胞的核尺寸，且组成性激活的RhoA G14V可绕过Kindlin-1缺失引起的核形态扰动。
四、讨论与结论总结
本研究发现Kindlin-1在调节核形态中发挥此前未被认识的核心作用，该功能依赖于Kindlin-1与整合素胞质结构域的相互作用。Kindlin-1的缺失导致黏着斑异常、F-肌动蛋白应力纤维和核上肌动蛋白丝的显著改变，以及核体积和表面积的减小。这些发现支持一个模型：Kindlin-1通过介导整合素信号和RhoA激活，调节核周肌动蛋白丝，进而影响核形态。研究还表明，Kindlin-2无法完全替代Kindlin-1在黏着斑调节和核尺寸维持中的功能。研究人员指出，细胞从细胞外基质脱离可导致多种细胞类型核体积的显著减小，而SCC13细胞分泌laminin 332，提示Kindlin-1可能通过β1整合素与laminin 332的结合和激活参与调节核特征的信号通路。此外，LINC复合物在核形态维持和质膜至细胞核信号传导中发挥关键作用，研究中观察到的lamin A/C与SUN1共定位模式的改变可能反映了LINC复合物的扰动。研究结论指出，Kindlin-1是整合素黏附体下游调节转化表皮SCC13细胞核尺寸和形态的关键因子，组成性激活的RhoA突变蛋白能够在缺乏Kindlin-1的情况下恢复这些核特征。这些发现提示，进一步研究RhoA激活是否在机械信号应答中依赖于Kindlin-1，以及Kindlin-1是否在特定亚群的表皮鳞状细胞癌细胞中发挥这些功能，可能为针对该通路的cSCC治疗干预提供潜在的靶点。
