《International Journal of Molecular Sciences》：Genome-Wide Characterization and Multidimensional Transcriptome Profiling of the SABATH Methyltransferase Gene Family in Sunflower (Helianthus annuus L.)
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植物SABATH甲基转移酶参与挥发性物质形成、激素稳态和胁迫响应，但其在向日葵中的全家族组织化特征仍不清楚。利用HanXRQr2.0-SUNRISE参考基因组，研究人员鉴定了33个高置信度HaSABATH基因，并结合系统发育、基因重复、共线性、启动子和蛋白质结
植物SABATH甲基转移酶参与挥发性物质形成、激素稳态和胁迫响应，但其在向日葵中的全家族组织化特征仍不清楚。利用HanXRQr2.0-SUNRISE参考基因组，研究人员鉴定了33个高置信度HaSABATH基因，并结合系统发育、基因重复、共线性、启动子和蛋白质结构分析，以及来自200个公共RNA测序（RNA-seq）文库（代表87种不同条件）的表达谱进行了综合分析。12个基因属于水杨酸/茉莉酸甲基转移酶相关的Clade I，19个属于苯甲酸/水杨酸甲基转移酶相关的Clade II，2个属于其他谱系。串联重复、近端重复、散在重复和全基因组/片段重复均对该家族有贡献，其中HaSABATH4和HaSABATH15存在重叠的串联和片段重复证据。11个可靠的非同义替换率与同义替换率比值低于1。大多数预测蛋白显示出较高的模型置信度。在所取样的条件下，Clade I成员通常表现出更高的表达水平和更广的表达范围，而许多Clade II成员表达较弱或具有条件偏好性。HaSABATH4和HaSABATH6被优先推荐用于盐碱复合胁迫下的后续研究。这一整合分析将进化背景与表达分化联系起来，并为靶向的生化与遗传学研究提供了候选基因。
研究背景与科学问题
向日葵（Helianthus annuus L.）是一种重要的油料和观赏作物，其产量和品质常受干旱、盐碱复合胁迫等非生物胁迫以及菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）感染和向日葵列当（Orobanche cumana）寄生等生物胁迫的影响。SABATH甲基转移酶家族编码一类植物小分子甲基转移酶，催化植物激素和次生代谢物的羧基或氮甲基化反应，参与花香形成、昆虫互作和防御信号传导。尽管在拟南芥、水稻、丹参、大豆、棉花、茶树等物种中已有全基因组水平的SABATH家族鉴定研究，但在向日葵中，该家族的谱系组成、重复历史和表达分化的整合认知仍然缺乏。此前一项关于盐碱复合胁迫的研究报道了一个注释为苯甲酸羧基甲基转移酶的向日葵基因座具有基因型关联的表达变化，但其所属的SABATH家族的整体组织特征尚未阐明。因此，本研究旨在解决三个探索性问题：向日葵SABATH家族的谱系组成是什么；不同的重复模式如何促进家族扩张；不同谱系和重复背景的成员在组织、激素处理和胁迫条件下的表达有何差异，并据此筛选优先候选基因。
主要技术方法概述
研究人员基于HanXRQr2.0-SUNRISE参考基因组，采用隐马尔可夫模型（HMM）搜索和BLASTP验证进行基因鉴定；利用MAFFT多序列比对和IQ-TREE最大似然法构建包含148条序列的多物种系统发育树；通过MCScanX软件进行种内和种间共线性及重复类型分析；使用PAML软件的yn00程序计算非同义替换率与同义替换率的比值（Ka/Ks）评估选择压力；从200个公共RNA测序（RNA-seq）文库（涵盖87种不同条件，包括盐碱复合胁迫、干旱、碱性胁迫、聚乙二醇渗透胁迫、盐胁迫、列当寄生、菌核病感染、多种激素处理及不同器官组织）构建多维转录组表达图谱；采用ColabFold/AlphaFold2进行蛋白质三维结构预测并评估模型置信度。
研究结果
2.1 全基因组鉴定与基本特征
通过HMM搜索和BLASTP验证，共鉴定出33个高置信度HaSABATH基因，按染色体位置命名为HaSABATH1至HaSABATH33。这些蛋白质长度为352~459个氨基酸，均为亲水性蛋白。BLASTP最佳匹配分析显示，78.8%的HaSABATH蛋白在拟南芥中的最佳匹配位于本研究的Clade II（BAMT/BSMT相关谱系）。
2.2 系统发育分析与谱系分类
包含148条序列的多物种最大似然树解析出两个主要分支和一个残余组（Other lineages）。Clade I（SAMT/JMT相关）包含47条序列，其中12个HaSABATH成员；Clade II（BAMT/BSMT相关）包含51条序列，是最大的向日葵SABATH分支，含19个HaSABATH成员，全部位于Core BSMT亚支；Other lineages包含50条序列，仅有HaSABATH10和HaSABATH22两个成员，其中HaSABATH22与拟南芥IAMT1聚类，被注释为IAMT样候选基因。
2.3 保守基序与基因结构
MEME分析鉴定出10个保守基序，其中基序1和基序3存在于所有33个成员中，基序2仅缺失于Other lineages的两个蛋白。基序分布在不同系统发育组间存在差异。基因结构分析表明，84.8%的HaSABATH基因含有4个外显子，与拟南芥SABATH家族的外显子保守性一致。
2.4 染色体定位、重复类型与共线性
33个HaSABATH基因不均匀分布于10条染色体上，chr11和chr2分别含有7个和6个成员。MCScanX鉴定出4对串联重复、11个近端重复、8个散在重复和8个全基因组/片段重复（WGD/segmental）基因。HaSABATH4和HaSABATH15同时具有WGD/片段重复和串联重复的双重证据。种间共线性分析检测到少量直接锚定关系，主要集中在双子叶植物比较中。
2.5 Ka/Ks选择压力分析
13个候选比较中，11个获得可靠的Ka/Ks估计值，均低于1（范围为0.082~0.537），表明所分析的重复对和姐妹对主要受到纯化选择而非正选择约束。
2.6 启动子顺式元件分析
启动子分析预测了光响应、胁迫和激素相关的顺式调控元件，其中光响应元件最为丰富。Clade II基因与其他基因在八个功能类别上的元件丰度经多重检验校正后未发现显著差异。
2.7 多维转录组表达谱
表达图谱揭示了显著的表达异质性。Clade I成员总体表达水平更高、表达范围更广，而Clade II成员多数表达较弱或具有条件偏好性。在盐碱复合胁迫下，HaSABATH4和HaSABATH6在耐性材料K-27根中显著上调，而在敏感材料K-7中几乎不表达，被确定为优先候选基因。在菌核病数据集中，HaSABATH16具有整个矩阵中最高的表达值，但因其在模拟对照中也同样高表达，被判定为头状花序相关的高表达候选基因而非病原体特异性诱导基因。在列当数据集中，多个成员在抗性和感病材料间存在表达差异，但这些差异在处理前就已存在。
2.8 蛋白质结构预测置信度
AlphaFold2预测显示，22个模型的平均pLDDT值≥90，整体模型置信度较高。仅HaSABATH24的平均pLDDT低于80（78.04），表明其局部结构预测存在不确定性。
讨论与结论
讨论部分要点：向日葵SABATH成员集中在BAMT/BSMT相关的Clade II，这为研究其在花部挥发物或防御相关代谢中的潜在功能提供了候选资源，但底物特异性不能仅从拷贝数推断。转录组分析揭示的谱系间和谱系内表达差异，特别是Clade I中WGD/片段重复组的更高表达，提示重复事件可能与表达分化相关。对于盐碱复合胁迫候选基因，HaSABATH4和HaSABATH6的不同时间表达模式可能反映了对上游信号的不同响应。研究也指出了局限性，包括系统发育树部分节点支持率中等、底物特异性和酶活性未经实验验证、表达分析基于跨项目平均值需独立验证等。
结论部分翻译：本研究通过整合系统发育分类、重复历史、种间共线性、启动子架构、结构预测置信度和多维转录组图谱，为向日葵HaSABATH家族建立了一个高置信度框架。局部重复和WGD/片段重复共同塑造了该家族，其中HaSABATH4和HaSABATH15保留了重叠的重复证据。有限的直接种间HaSABATH锚定表明可检测到的共线性保守集中于少数基因，而11个可靠的Ka/Ks估计值低于1支持所分析配对主要受到纯化约束。大多数预测结构具有高整体置信度且符合预期的SABATH架构，但这些模型并不确立底物特异性或酶活性。在所取样的条件下，Clade I成员通常表现出更高的表达水平和更大的表达广度，而许多Clade II成员表达较弱或具有条件偏好性。综合证据优先推荐HaSABATH4和HaSABATH6用于盐碱复合胁迫下的后续研究；广泛表达的HaSABATH31和在头状花序中高表达的HaSABATH16也值得进一步研究。这些资源为未来向日葵SABATH功能在胁迫适应和次生代谢中的遗传与生化验证提供了基础。
